[发明专利]一种茶叶黄嘌呤氧化酶拮抗剂高通量筛选方法

说明书

本发明一种茶叶中黄嘌呤氧化酶拮抗剂的高通量筛选方法，属于茶叶中活性成分筛选技术领域，具体包括以下几个步骤：1）茶叶提取液的制备；2）茶叶提取液与黄嘌呤氧化酶进行共同孵育；3）超滤去除与黄嘌呤氧化酶未结合的化合物；4）解离获取与黄嘌呤氧化酶结合的化合物；5）化合物结构鉴定；6）化合物抑制黄嘌呤氧化酶活性测定。该方法具有操作简便、快速、成本低、筛选效率高等优点。

技术领域

本发明属于茶叶中活性成分筛选技术领域，更具体地说，涉及一种茶叶中黄嘌呤氧化酶拮抗剂的高通量筛选新方法。

背景技术

高尿酸血症是由嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍所致的血尿酸增高，细胞外液尿酸呈超饱和的状态。5％-12％高尿酸血症患者会发展成为痛风，侵犯骨和关节，而且容易累积肾脏和心血管系统。高尿酸血症和痛风已成为危害人类健康的一种严重的代谢性疾病。嘌呤代谢过程中关键酶的异常是尿酸生成增加的主要原因。黄嘌呤氧化酶是促进尿酸合成的一种关键酶，其拮抗剂可能具有降低人体尿酸的功效。因此从天然植物中筛选黄嘌呤氧化酶拮抗剂具有重要的意义。

茶是世界上最受欢迎的饮品之一，也是一种天然保健品。据统计，茶叶中含有450多种对人体有益的化合物成分。研究表明饮茶能够明显降低机体内尿酸水平，从而缓解痛风。然而由于茶叶是一个复杂的混合物，目前关于茶叶中具有降尿酸作用的化合物尚不明确，阻碍了茶叶来源的降尿酸保健品和降尿酸药物的开发，因此急需开发能够从茶叶复杂的混合物溶液中筛选具有降尿酸功效化合物的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种茶叶中黄嘌呤氧化酶拮抗剂的高通量筛选新方法。该方法将“黄嘌呤氧化酶-茶叶化合物”亲和作用、超滤、基于液相色谱-质谱的代谢组学方法结合起来，用来高通量筛选茶叶中具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的化合物。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的一种茶叶中黄嘌呤氧化酶拮抗剂的高通量筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

1)茶叶提取液的制备；

2)茶叶提取液与黄嘌呤氧化酶进行共同孵育；

3)超滤去除与黄嘌呤氧化酶未结合的化合物；

4)解离获取与黄嘌呤氧化酶结合的化合物；

5)化合物筛选及结构鉴定；

6)化合物抑制黄嘌呤氧化酶活性测定。

进一步地，步骤1)中茶叶提取液的制备方法为：以浓度为0％-99％的甲醇水溶液或乙腈水溶液提取茶叶中的化合物，提取温度为10-90℃，提取时间为2-120分钟。

进一步地，步骤2)中茶叶提取液与黄嘌呤氧化酶共同孵育的步骤为：将茶叶提取液和黄嘌呤氧化酶溶液等体积进行混合，然后进行水浴孵育，孵育温度为15-45℃，孵育时间为0.1-48小时，设为XOD组，同时设置对照组：将茶叶提取液和pH＝6.8的磷酸缓冲溶液等体积进行混合，然后进行水浴孵育，孵育温度和孵育时间同XOD组。

进一步地，步骤3)中超滤去除与黄嘌呤氧化酶未结合的化合物的方法为：孵育结束后，将茶叶提取液和黄嘌呤氧化酶溶液的混合液进行离心超滤，超滤管规格为3KD至500KD，离心转速为13000-15000g；并添加去离子水进一步清洗未与黄嘌呤氧化酶结合的化合物，清洗2-10次，弃去清洗溶液。

进一步地，步骤4)中解离获取与黄嘌呤氧化酶结合的化合物的方法为：添加0.5-10mL甲醇水溶液于上述去离子水清洗后的超滤管中，使与黄嘌呤氧化酶相结合的化合物解离至甲醇水溶液中，进一步进行离心超滤，离心转速为13000-15000g；收集甲醇水溶液。