[发明专利]一种陆地棉基因组的高效定向基因调控的编辑方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种陆地棉基因组的高效定向基因调控的编辑方法，本发明对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的GhBE3‑Dcas9载体进行改造，以6TAL‑2VP64+2linker+dCas9融合蛋白取代原有的APOBEC1‑XTEN‑dCas9‑UGI蛋白，构建在棉花中具有定向上调单个基因表达量的载体Gh‑dCas9‑TV。选取GhEPSP和GhPAP1D为目标基因验证Gh‑dCas9‑TV在棉花中的应用。设计2个单靶标以及一个双靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将转录激活编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行表达量检测和转录组测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率及全基因组和全转录组检测靶标基因，非靶标基因表达量效应。本发明具有良好的编辑效率和特异性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种陆地棉基因组的高效定向激活编辑方法，本发明涉及构建陆地棉的高效转化载体，并利用本发明的载体在陆地棉功能基因组中进行转录激活，调控基因表达上调。

背景技术

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点，在基因敲除、敲入、碱基替换、表观遗传修饰等领域得到了广泛的应用[1]。CRISPR/Cas9基因编辑系统由一个具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白(或其他同源蛋白)和一条单链向导RNA(single guide，sgRNA)组成。Cas9是在细菌中发现的特异性DNA核酸内切酶，其来源于如化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌等，其具有两个核酸酶结构域，即HNH结构域和RuvC结构域。当sgRNA与Cas9蛋白结合靶向到基因组特定位点，Cas9切割双链产生双链断裂(doublestrand breaks，DSB)，经过细胞自主性的非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homology-directed repair，HR)进行修复，引入突变[2]。2013年，Qi等人将CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的两个保守的内切核酸酶结构域进行突变，使Cas9蛋白失去内切核酸酶活性使其成为dCas9，dCas9不能切割DNA但仍能与特定DNA序列结合[3]。

dCas蛋白(如dCas9)可与转录抑制结构域(TRD)或转录激活结构域(TAD)融合，dCas蛋白可以与效应蛋白融合，包括转录激活子、抑制子和表观调节子，分别实现有效的基因特异性CRISPR介导的激活(CRISPRa)、干扰(CRISPRi)和表观基因组修饰[4]。转录调控因子本质上是嵌合蛋白，其DNA结合结构域与控制转录机制的功能结构域相连，促进关键辅因子的募集从而调控转录[5]。转录调控因子一方面包括转录阻遏因子，例如KRAB结构域，通过募集共抑制因子来抑制转录，最终导致基因沉默[6]；一方面即转录激活因子，例如VP16(单纯疱疹病毒蛋白16)，通过招募和稳定启动前复合物的一般转录因子来激活转录[7]。

基因表达涉及多个生命过程，包括DNA转录成信使RNA(mRNA)、mRNA的剪接、翻译和翻译后修饰。精确控制DNA转录成mRNA的过程，是全面控制基因表达这一复杂过程的第一步。精确调控基因表达，将会有助于我们对细胞生理学的理解，这对于生物技术的进步是必不可少的。传统的过表达技术，由于繁琐的靶标基因克隆步骤、载体容量限制、对多个启动子和终止子的要求以及T-DNA插入位点差异导致的外源基因表达水平参差不齐，因此这种方法对基因表达尤其是多基因表达研究效率低下。CRISPR/dCas9的转录激活系统的出现加快了基因调控网络、合成生物学、农艺性状改良等方面研究进展。

目前，转录激活系统在很多物种中被报道，但在异源四倍体的棉花中尚未出现报道。棉花是重要的经济作物，棉花纤维是纺织工业重要的天然纤维，棉籽油也是重要的油料储备[8]。在棉花中开发新的可行而又有效的定向调控基因工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良和新品种选育提供重要技术支持。

发明内容

(一)解决的技术问题