[发明专利]靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用

说明书

本发明公开了靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用，属于生物医药技术领域。通过构建重组慢病毒质粒ARID1A sgRNA‑lentiCRISPR v2、将CRISPR/Cas9慢病毒系统通过293T细胞进行包装获得慢病毒颗粒、将慢病毒颗粒感染目的细胞株、有限稀释法传代筛选，可获得稳定的ARID1A基因敲除的细胞株。Western blot蛋白表达检测显示，基因敲除的细胞株ARID1A蛋白表达完全缺失。另外，ARID1A基因敲除的细胞株增殖能力明显增强。结果表明，利用CRISPR/Cas9慢病毒系统成功敲除ARID1A基因后，可促使胃上皮细胞的恶性转化。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用。

背景技术

ARID1A(AT-rich interactive domain-containing protein 1A)基因位于人第1号染色体1p35.3，长约86kb，包含20个外显子，编码一个定位于细胞核、相对分子量约为240kDa的蛋白。ARID1A蛋白是SWI/SNF染色质重塑复合物的重要组成亚基，参与染色质重塑，如DNA的复制、转录和损伤修复等过程，是细胞核活动的关键成员，调控基因的表达。新近研究发现，染色质重塑复合物分子基因型的改变是肿瘤发生发展的新机制。ARID1A突变缺失导致的染色质重塑异常进而引起基因表达调节紊乱，与多种肿瘤的发生发展密切相关。基因组测序研究显示：在胃癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均存在高频的ARID1A突变。但ARID1A突变缺失后，促进肿瘤发生发展的具体分子机制尚未明确。

胃癌位居世界恶性肿瘤发病率的第五位，死亡率的第三位。晚期胃癌患者五年生存率低于30％，而目前仍缺乏有效的治疗方案。因此，深入研究胃癌发生发展的分子机制，对探索胃癌诊治的新靶点、促进精准医疗具有重要意义。

既往研究多采用RNA干扰技术研究胃癌相关基因。然而，RNA干扰只能低效率的敲低基因的表达，并不能实现基因的突变缺失，限制了ARID1A突变缺失在胃癌中的分子机制的研究。

CRISPR/Cas9系统是细菌和古生菌等原核生物在进化过程中，抵抗噬菌体或质粒等外源DNA入侵的一种获得性免疫防御系统，也是一种由RNA介导的核酸内切酶系统。经过人工改造后，Cas9蛋白可在与靶向序列互补的sgRNA的引导下，定位到基因组与PAM序列相邻的靶向序列进行剪切导致DSBs，通过NHEJ或HDR修复机制引入突变或新的基因，实现对真核细胞高效的、特异的基因编辑。CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向位点选择灵活、效率高、载体构建方法简单，是近年来基因编辑领域的重大研究突破和研究热点。

采用该系统进行特定基因的精准敲除、构建基因突变缺失细胞株，关键之处为sgRNA的设计。在sgRNA设计时，需注意位置、序列、特异性评分、有效性、脱靶等众多参数，才能提高sgRNA的打靶效率。当前国内尚未见研究报道与胃癌相关的ARID1A基因敲除的sgRNA设计，因此，通过设计ARID1A基因敲除的sgRNA，构建能在体外长期培养的ARID1A突变缺失的稳定人胃上皮细胞株，在探索胃癌发生新机制和新诊治靶点中具有重要的研究和应用价值。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，所述sgRNA为Exon2-sgRNA或Exon3-sgRNA；其中，Exon2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Exon3-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还公开了一种CRISPR/Cas9质粒，含有上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA。