[发明专利]一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及其构建方法

说明书

本发明公开了一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及构建方法，本发明将Werner早老综合症模型小鼠与p53N236S基因敲入小鼠杂交后，得到Wrn‑/‑mTerc‑/‑p53^S/^S。该小鼠的胚胎成纤维细胞不会出现衰老表型，且其端粒长度与DKO MEF相比得到明显的恢复。说明由于mTerc以及Wrn基因缺失造成的端粒功能异常可以通过p53S的表达而得到改善。该小鼠ALT细胞模型相较于人类的ALT细胞系，其遗传背景清楚，可用于开展如ALT形成分子机制，针对端粒酶阴性的肿瘤药物筛选等工作，且获得方式简单，操作性强，有相应的动物模型作为进一步验证实验结果的支撑。

技术领域

本发明涉及动物基因工程领域，特别是涉及一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及其构建方法。

背景技术

端粒是位于真核生物染色体末端的结构，其功能对增殖细胞的基因组稳定性和生存至关重要。端粒在每次细胞分裂过程中都会缩短，当端粒缩短到一定程度就会导致端粒损伤和复制性衰老。而肿瘤细胞往往通过激活端粒维持机制(telomere maintenancemechanism，TMM)来保证细胞快速增殖的状态和基因组的稳定。大多数人类肿瘤选择激活端粒酶(端粒酶是一种以RNA为模板延伸端粒长度的酶)作为其端粒维持机制，以绕过复制性衰老。然而，大约10％-15％的人类肿瘤通过一种与端粒酶无关但依赖于重组的途径来维持端粒。这种途径被称为端粒延长替代机制(Alternative Lengthening of Telomeres，ALT)。

当前研究认为，ALT是一种依赖于端粒序列特异性同源重组的端粒维持机制，端粒利用其它端粒DNA作为模板延长端粒，以抵消由于连续的细胞分裂而导致的端粒缩短。研究证明，ALT的发生总是伴随着一些特征性表型的出现，包括以下几个方面：细胞具有高度异质性、端粒长度不均一、端粒姐妹染色单体互换(T-SCEs)、大量染色体外端粒重复序列DNA(ECTR)以及含有一种特殊的端粒DNA核结构，称为ALT相关的PML小体(APBs)。

由于现有的ALT细胞系大多是人类间充质来源的，少有小鼠ALT细胞系和自发ALT肿瘤小鼠模型的报道，从而限制了ALT机制的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及其构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，该模型以mTerc^-/-Wrn^-/-转基因小鼠和p53^S/S转基因小鼠通过杂交，得到不同代数(指小鼠的代数，由于初代mTerc^-/-Wrn^-/-小鼠的端粒长度很长，因此需要将小鼠繁殖到G5代左右才会出现衰老表型)的mTerc^-/-Wrn^-/-p53^S/S小鼠的胚胎成纤维细胞为基础，以用于研究ALT发生的分子过程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

将基因型为mTerc^+/-Wrn^-/-的小鼠与基因型为p53^S/S的小鼠进行交配，得到基因型为mTerc^+/-Wrn^+/-p53^S/+的杂合子小鼠；其中，所述基因型为p53^S/S的小鼠为p53N236S突变基因敲入的小鼠；

将基因型为mTerc^+/-Wrn^+/-p53^S/+的杂合子小鼠交配，获得mTerc基因敲出的纯合子代；

将mTerc基因敲出的纯合子代交配，获取小鼠胚胎成纤维细胞，作为端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型。