[发明专利]豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用，具体为一种基于共价印迹及印迹后修饰方法制备豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱。以豆蔻酰化四肽为模板，利用功能单体4‑烯丙氧基苯甲醛中的醛基与模板分子中的氨基发生共价反应形成席夫碱的特点得到模板‑功能单体复合物，除去模板分子后，再利用氢氧化钠的歧化作用使醛基发生歧化反应变成羟基和羧基，得到印迹后修饰的分子印迹整体柱。该方法简便易行，可提高印迹整体柱的富集效果，对于豆蔻酰化蛋白组学的研究具有重要的研究意义。

技术领域

本发明涉及一种豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用，具体为一种基于共价印迹及印迹后修饰方法制备豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱。以豆蔻酰化四肽（Myristoylated tetrapeptide）为模板，利用共价印迹方法合成新型印迹整体柱，并通过印迹后修饰方法对整体柱进行后处理，解决了模板与功能单体再结合困难的问题，而且提高了印迹整体柱的富集效果，增强了豆蔻酰化修饰的多肽鉴定能力，在修饰蛋白组学领域有良好的应用前景。

背景技术

蛋白质N-豆蔻酰化修饰是由豆蔻酰化转移酶介导的，在蛋白质N端甘氨酸上共价连接上14-碳饱和脂肪酸的一种重要的蛋白质翻译后修饰。其首次发现是在1982年，cAMP依赖性蛋白激酶的N端被豆蔻酰化，目前已确定了100多种豆蔻酰化蛋白质，包括丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、激酶底物蛋白、磷酸酯酶和参与信号传导的其他蛋白，主要参与细胞生长发育、信号传导、肿瘤发生及病毒复制组装等生理过程。由于本身的低丰度、强亲脂性和差抗原性，目前常规的检测方法是放射性同位素标记法，但是存在耗时、价格昂贵、易产生有毒物质等问题。另一种方法是采用叠氮肉豆蔻酸类似物对蛋白质进行代谢标记，然后通过生物素偶联的捕获试剂富集。该方法的优点是背景标记少，但是，由于高度混杂的脂肪酰化机制和脂肪酸代谢，特异性较差。因此，研究豆蔻酰化蛋白质直接高效富集方法对于豆蔻酰化蛋白质组学的鉴定具有很大的研究意义。

分子印迹是为模板分子量身定做的具有识别性能高聚物材料的合成技术，该法制备的分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）具有与目标分子形状和功能基高度匹配的三维空穴，可实现对目标分子“锁-钥”模式的识别，是优异的选择性分离及纯化手段。MIP具有选择性强、稳定性好、方法简单等优点，目前常用于固相微萃取、电化学传感、色谱分离等领域。分子印迹技术大多采用非共价印迹法，即模板与功能单体间通过非共价键（氢键、离子键、配位键等）相互结合，该方法具有操作简便的优点，但存在选择性差，容易产生非特异性吸附等问题，因此在蛋白组学的研究较少，发展相对缓慢。近来，针对蛋白质翻译后修饰发展了一些分子印迹新技术，如基于硼酸配体与顺式二羟基化合物可逆结合的原理的硼亲和分子印迹技术可实现对糖蛋白的特异性识别与富集；基于磷酸基团与金属离子的亲和力与分子印迹技术相结合，可以选择性地对磷酸化蛋白质及肽段进行富集与纯化等，但这些方法难于用于豆蔻酰化肽的富集。

为了解决这一问题，本发明通过共价印迹法结合印迹后修饰方法为豆蔻酰化肽的特异性识别开辟一条新的途径。

共价印迹法是指模板分子与功能单体以共价键的形式结合形成模板-功能单体复合物，该复合物在交联剂的作用下连接到聚合物基质上。例如，中国专利 CN201610480736. 2 利用共价印迹法，通过丹参素与丙烯醇的共价结合, 在交联剂、引发剂、致孔剂的作用下制备丹参素的分子印迹聚合物，用于从丹参中选择性地提取丹参素。目前，常见的共价键包括硼酸酯、席夫碱、缩醛（酮）等。其中，席夫碱是指由醛或酮与氨或胺缩合形成具有亚胺或甲亚胺特性基团（－C=N－）的一类有机化合物。迄今为止，尚无涉及基于合成席夫碱的共价印迹方法制备的豆蔻酰化四肽分子印迹整体柱的专利申请件。利用此原理制备印迹整体柱，可以提高对模板分子的选择性，成功地解决了非共价印迹方法存在的非特性吸附问题，但是共价印迹方法存在模板-功能单体再结合困难的问题。