[发明专利]一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用，该果胶裂解酶突变体ΔPelG403为将野生型果胶裂解酶PelG403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸；其氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明提供的突变体酶在碱性条件下，酶活力和耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，为利用该酶在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中的应用创造了良好条件。

技术领域

本发明属于分子生物学的技术领域，更具体地，涉及一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。

背景技术

果胶裂解酶(Pectate lyase，简称Pel，EC 4.2.2.2)通过反式消去作用以随机方式切割果胶酸或果胶的α-1，4-糖苷键，生成C₄-C₅不饱和寡聚半乳糖醛酸；其最适pH一般在碱性范围，催化作用依赖于Ca²⁺。Starr和Moran于1962年在Erwinia carotovora和Bacilluspolymyxa的培养物中首次发现果胶裂解酶；随后，在Penicillium sp.、Paenibacillus sp.和Psedomonas sp.等微生物资源中均发现了果胶裂解酶。

果胶裂解酶被广泛应用于许多领域，如造纸、咖啡和茶发酵、纺织和植物纤维加工、采油和处理工业废水等。

作为一种重要的清洁生产用酶，果胶裂解酶备受关注，其主要应用于纸浆漂白和纺织品的生物精炼等行业。酶解精炼方法能从根本上解决传统工艺存在的环境和能源等问题，在质量与环保方面具有传统工艺无法比拟的优点。果胶裂解酶的工业化应用主要取决于其酶活力的最适温度、最适pH、稳定温度和稳定pH等酶学性质。因此，从微生物菌种资源中发掘优良的果胶裂解酶，选择适合工业化生产应用的果胶裂解酶是关注的焦点之一。

果胶裂解酶在工业化应用过程中常会遇到高温环境，温度过高会破坏果胶酶蛋白中的盐桥、氢键、范德华力和疏水相互作用等非共价键，从而破坏果胶酶的空间结构，使其从折叠状态变为相对展开状态，果胶酶活力降低，甚至酶失活。据报道，目前大多数果胶裂解酶都来源于常温微生物，其在50℃下保温1h，基本全部失活。

随着分子生物学技术的发展，对现有果胶裂解酶进行分子改造，是获得高酶活力和耐高温优良酶种的有效手段之一。定点突变是基于果胶裂解酶已知或预测的结构信息及催化机理，对其结构与功能关系进行分析，推测出影响酶稳定性、催化活性等的主要位点，再对其关键位点进行修饰或替换；其具有突变率高、重复性好等优点，已被广泛用于酶性能的改良。

截至目前，尚未见到点突变改造果胶裂解酶的有关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其将柔性区第 129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸。

具体地，在上述技术方案中，通过将位于第128-137位的柔性区(无规卷曲和转角区)中的第129位的氨基酸进行点突变，具体为在 GenBank数据库中公布的pelG403基因序列(GenBank登录号： JX964998)的基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第129位丙氨酸，增加柔性区域的分子间作用力(范德华力等)，从而提高酶的耐热性。

进一步地，在上述技术方案中，所述果胶裂解酶突变体ΔPelG403 的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码所述果胶裂解酶突变体的基因ΔpelG403。