[发明专利]一种转氨酶突变体及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种转氨酶突变体以及其编码基因，以及其在微生物催化2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物不对称合成L‑草铵膦中的应用。所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，其突变体是将SEQ ID:1所示的氨基酸序列的第138和141位中的一个进行单位点突变或组合突变获得的。本发明实现了高转化率转氨酶活力突变体基因的高效表达，酶活最高可达3827U/g。本发明转氨酶突变体在温度40℃，以pH 8.0缓冲液为反应介质进行生物催化反应获得L‑草铵膦，收率高达99％，产物e.e.值达到99％，具有较好应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种转氨酶突变体以及其编码基因，以及其在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦(Phosphinothricin，PPT)作为一种非天然氨基酸除草剂，与百草枯、草甘膦名列世界三大除草剂。因为其高效和低毒的非选择性而被广泛使用，最早是由德国的Bayer科研团队从吸水链霉菌的发酵液中发现的，具有良好的除草效果，它主要作用是抑制植物体内的谷氨酰胺合成酶(GS)，使其氮代谢紊乱，导致植物发生铵中毒而死，同时也影响了植物的光合作用，无法合成叶绿素，最后植物逐渐枯黄死去。

目前市售的草铵膦均为外消旋混合物，外消旋PPT具有L型和D型两种构型，但其中只有L构型的具有除草效果，且能在土壤微生物的作用下迅速降解。如果草铵膦产品能够以L-构型生产和销售的话，对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要的意义。

目前报道生产光学纯L-草铵膦主要有化学合成法、手性拆分法以及生物催化合成法。

化学合成法主要有低温定向合成法、手性辅基法、天然氨基酸合成法、不对称催化合成法，不对称合成又包括不对称催化加氢合成法、不对称Michael加成方法等。目前化学法合成面临反应路线繁琐，对反应条件比较苛刻，后期污染较严重，且不对称合成试剂价格昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，分离D型和L型异构体，从而得到光学纯的L-草铵膦。但是使用此法需要用到昂贵的手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低并且工艺比较复杂。

生物催化合成法具有反应条件温和、催化效率和立体选择性高、产物易于分离纯化、环保零污染等优点，并逐渐成为当前研究热点。L-草铵膦的生物酶法合成研究具有重要的意义和经济价值。生物合成L-PPT主要有酶水解法、酶选择性拆分法和酶的不对称合成法，其中涉及到的酶类主要有：蛋白酶、酰胺酶、脱乙酰基酶、转氨酶。

在诸多草铵膦的酶法合成路线中，不对称合成法具有立体选择性严格、反应条件温和，收率高以及容易分离纯化等优点，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线，催化此类反应的酶主要包括谷氨酸脱氢酶和转氨酶，底物为草铵膦前体酮(2-羰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-丁酸，PPO)。谷氨酸脱氢酶催化时，需要使用昂贵的NAD(P)H作为辅助因子，催化成本过高。

转氨酶(Transaminase,TA,EC 2.6.1.X)作为磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)依赖型酶，能催化胺类化合物上的氨基转移到潜手性的酮类化合物上，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸。转氨酶普遍存在于微生物、动物和植物组织中，并在胞内氮代谢过程中起着重要的转氨作用。转氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，这些手性化合物常作为药品的活性成分或主要中间体被使用，例如，广谱触杀型除草剂草铵膦、治疗糖尿病药物的西他列汀及抗生素青霉素等，在制药工业、农业、化工业都有重要的作用。