[发明专利]一种DNA的合成方法

权利要求书

1.一种DNA的合成方法，其特征在于，包括：

将待合成DNA的序列分割为n个序列片段，其中，n≥2且为偶数，所述序列片段的长度为50-150bp，

针对每个序列片段设计一条引物，所述引物包含所述序列片段的全部序列或其反向互补序列，

所述引物中，第i个序列片段的引物为正向引物，第i+1个序列片段的引物为反向引物，第i个序列片段的引物的3’端与第i+1个序列片段的引物的3’端存在第一反向互补配对区域，其中，i为1～n-1范围内的所有奇数，

利用第i个序列片段的引物与第i+1个序列片段的引物组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，

所述PCR扩增的反应体系不包含模板DNA。

2.根据权利要求1所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述第一反向互补区域的长度为12-25bp。

3.根据权利要求1或2所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述引物中，第x个序列片段的引物的5’端与第x+1个序列片段的引物的5’端存在第二反向互补配对区域，其中，x为2～n-2范围内的所有偶数；

优选地，所述第二反向互补配对区域的长度为12-80bp。

4.根据权利要求3所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述第一反向互补配对区域的Tm值为40-70℃。

5.根据权利要求3或4所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述第一反向互补配对区域与除其以外的待合成DNA的其他区域的互补配对碱基数量≤6个。

6.根据权利要求1～5任一项所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述PCR扩增包括如下步骤：94-98℃预变性0.5-5min，94-98℃变性10-20s、T℃退火10-20s、68-72℃延伸8-15s、18-25个循环，68-72℃延伸25-60s，

其中，退火温度T为：

当Tm≥65℃时，T＝Tm-5℃；

当60℃≤Tm＜65℃时，T＝60℃；

当55℃≤Tm＜60℃时，T＝Tm；

当Tm＜55℃时，T＝50℃；

Tm为第一反向互补配对区域的Tm值。

7.根据权利要求6所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包含如下组分：DNA聚合酶、反应缓冲液、引物对和dNTP，

所述反应体系中，所述引物对中每条引物的浓度均为0.4-0.5pmol/μL。

8.根据权利要求7所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包含如下组分：1×反应缓冲液，DNA聚合酶1-3U/μL，正向引物0.4-0.5pmol/μL，反向引物0.4-0.5pmol/μL，dNTP0.1-0.3mM，水补足余量。

9.根据权利要求1～8任一项所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述方法还包括将所述PCR产物之间进行连接的步骤以及将所述PCR产物的连接产物与载体进行连接的步骤，

所述PCR产物之间的连接采用同源重组的方法进行。

10.根据权利要求1～9任一项所述的DNA的合成方法，其特征在于，所述待合成DNA的长度为150-500bp。