[发明专利]追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法

说明书

本发明公开一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，构建单溶酶体质谱检测模型；然后用亲溶酶体物质对细胞进行孵育，并通过所述单溶酶体质谱检测模型对细胞中单溶酶体的内容物进行检测。本发明通过构建单溶酶体质谱检测模型，来追踪亲溶酶体内容物在单溶酶体中的贮积情况，检测单溶酶体内容物的变化，实现了跟踪检测单溶酶体内的代谢情况，并为减少临床亲脂性弱碱药物的副作用或耐药性提供理论依据。

技术领域

本发明涉及溶酶体内容物追踪技术领域，具体为一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法。

背景技术

现有技术可以通过膜片钳技术记录的电信号的差异来区别不同的溶酶体，却无法对单溶酶体内的成分进行分析。对溶酶体内的成分分析目前还是依赖于匀浆处理，而匀浆处理的方法将溶酶体长时间暴露于非细胞环境，易造成样品损失及代谢副产物的产生。Kelly,B.M.等人报道的文章《人成纤维细胞溶酶体的异质性》，发现溶酶体是异质性细胞器，它的形态、大小、活性及功能各不相同，因此，上述匀浆处理的方法无法对单溶酶体内容物进行定性定量分析。Zhitomirsky,B.通过研究发现疏水性弱碱类药物容易被溶酶体捕获，而疏水性弱碱类药物被溶酶体捕获后，现有技术无法跟踪检测其在单溶酶体内的代谢情况。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，来解决现有技术无法跟踪检测单溶酶体内的代谢情况的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，构建单溶酶体质谱检测模型；然后用亲溶酶体物质对细胞进行孵育，并通过所述单溶酶体质谱检测模型对细胞中单溶酶体的内容物进行检测。

本发明中，通过构建单溶酶体质谱检测模型，来追踪亲溶酶体内容物在单溶酶体中的贮积情况，检测单溶酶体内容物的变化，实现了跟踪检测单溶酶体内的代谢情况，并为减少临床亲脂性弱碱药物的副作用或耐药性提供理论依据。

优选地，所述构建单溶酶体质谱检测模型包括膜片钳、质谱仪，所述膜片钳用于提取单溶酶体中的内容物，所述质谱仪用于对获取的单溶酶体中的内容物进行质谱检测。

优选地，所述方法包括以下步骤：

步骤一、用亲溶酶体物质对细胞进行孵育；

步骤二、将步骤一孵育后的细胞采用单溶酶体膜片钳技术获取单溶酶体中的内容物；

步骤三、对步骤二获取的单溶酶体中的内容物进行质谱检测。

优选地，所述亲溶酶体物质包括疏水性弱碱类药物。

优选地，所述疏水性弱碱类药物包括利多卡因、吉西他滨中的至少一种。

优选地，所述细胞为HEK-293T细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠肺成纤维细胞、膀胱癌细胞、人膀胱上皮永生化细胞、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元、神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠淋巴成纤维细胞的至少一种。

优选地，所述步骤一采用吉西他滨药物分别孵育HEK-293T细胞、BxPC-3细胞0.5h、12h和36h。

优选地，本发明采用NH₄Cl电极内液，与传统电极内液相比，提高了质谱检测的信噪比，可以同时获得电生理和质谱信号。

优选地，所述吉西他滨(Gemcitabine)的浓度为10μM。

优选地，所述单溶酶体膜片钳技术采用的电极其电极尖端长度为5-10mm、尖端开口直径为0.1-2μm。以防止样品被电极外液稀释；质谱取样的电极外液是模拟溶酶体所处的胞质离子环境。