[发明专利]鉴定肺结节状态的方法和试剂盒

权利要求书

1.在受试者中鉴定肺结节状态的方法，包括以下步骤：

1)检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因的甲基化水平和/或miRNA的表达水平，其中所述生物标志物基因包括PTGER4、RASSF1A和SHOX2基因，所述miRNA包括miR-19b和miR-320a；以及

2)将步骤1)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物的正常甲基化水平进行比较，和/或将步骤1)检测的miRNA的表达水平与群体中相应miRNA的正常表达水平进行比较，以鉴定所述受试者的肺结节状态。

2.如权利要求1所述的方法，其中还包括在所述受试者接受医疗处理后再次进行步骤1)，并且将两次检测的甲基化水平和/或miRNA表达水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中肺结节状态的变化。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述肺结节状态包括良性肺结节和恶性肺结节，所述恶性肺结节状态包括肺癌的存在、进展、分期和/或亚型。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤1)包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变，接着使用甲基化特异性引物对以所述生物标志物基因或其片段为模板进行扩增反应来确定所述甲基化水平。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤1)中用于PTGER4基因甲基化水平检测的甲基化特异性引物对包括引物SEQ ID NO：6和7或引物SEQ ID NO：10和11；用于RASSF1A基因甲基化水平检测的甲基化特异性引物对包括引物SEQ ID NO：14和15或引物SEQ ID NO：18和19；用于SHOX2基因甲基化水平检测的甲基化特异性引物对包括引物SEQID NO：22和23或引物SEQ ID NO：26和27；用于miR-19b的表达水平检测的引物包括逆转录引物SEQ ID NO：33和扩增引物SEQ ID NO：34和35；用于miR-320a的表达水平检测的引物包括逆转录引物SEQ ID NO：37和扩增引物SEQ ID NO：38和39。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤1)中还包括利用引物对SEQ ID NO：30和31对内参基因ACTB甲基化水平进行检测，和/或利用逆转录引物SEQ ID NO：41和扩增引物对SEQ ID NO：42和43对内参miRNA let-7d的表达水平进行检测。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤2)中鉴定所述受试者的肺结节状态是根据所述生物标志物基因的甲基化水平通过逻辑回归进行的，是根据所述miRNA的表达水平变通过逻辑回归进行的，或是根据所述生物标志物基因的甲基化水平联合所述miRNA的表达水平变通过逻辑回归进行的。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、痰液、淋巴、脑脊液、胸水、支气管肺泡灌洗液、尿和组织活检。

9.用于在受试者中鉴定肺结节状态的试剂盒，包括用于检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平的试剂和/或用于检测来自所述受试者的生物样品中的miRNA的表达水平的试剂，其中所述生物标志物基因包括PTGER4、RASSF1A和SHOX2基因，所述miRNA包括miR-19b和miR-320a。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中用于检测甲基化水平的所述试剂包括用于通过扩增反应来确定所述甲基化水平的甲基化特异性引物对以及任选的亚硫酸氢盐。