[发明专利]一种赛门苷I的纯化制备方法

说明书

本发明公开了一种从生物催化反应体系中纯化制备高纯度天然甜味剂赛门苷Ⅰ（Siamenoside I）的方法。具体涉及去除细菌碎片和蛋白质、清除色素以及产物纯化制备。本发明综合应用除蛋白方法和离子交换树脂、大孔树脂等分离材料，建立了一种从生物合成体系中制备高质量赛门苷I的工艺，产品得率超过70%。该纯化制备过程只仅使用了水和乙醇，工艺简单、成本低、安全性高，有望产业化应用。

技术领域

本发明属于天然产物生物合成和分离纯化技术领域，具体涉及罗汉果苷类天然甜味剂赛门苷I的生物合成和纯化制备。

背景技术

进入21世纪后，随着人类生活水平不断提高，“三高”人群的数量也呈现出爆炸式增长，其中糖尿病已成为一种全球性慢性疾病，占据了大量的医疗资源。近年来，人们已逐渐意识到低糖饮食对健康的重要性。因此，天然甜味剂如甜菊苷、甜茶苷、甘草酸、莱鲍迪苷A、罗汉果苷等逐渐进入人们的视野，成为低热饮食添加剂的代名词，展现出了极高的商业价值。

赛门苷Ⅰ(siamenoside I)是一种来源自罗汉果的葫芦烷型四环三萜皂苷，其相对甜度是蔗糖的460-563倍，口感与蔗糖相似，已经被FDA认定为“一般公认安全”(GRAS)的成分。目前，赛门苷Ⅰ已成为众多饮料和食品公司开发新型低热量甜味剂的热点化合物。但是，赛门苷I的天然含量极低，不足0.5％，难以规模化生产。本研究组前期的发明专利(CN112063678A)公开了一种采用糖基转移酶和代谢流改造大肠杆菌成功生物合成赛门苷I的方法，为解决赛门苷I来源问题提供了一种可行的方案。不过，由于细菌成分的特殊性，纯化制备的赛门苷I常会掺入蛋白质和水溶性色素等杂质，致使产品质量难以控制。

本发明针对蛋白质和色素的理化性质，尝试了加热煮沸、活性炭吸附、乙醇沉淀、离子交换和物理吸附等方法，最终建立了纯化制备高质量赛门苷I的工艺，成功去除了蛋白质和色素的干扰，为赛门苷I的规模化生产提供技术。

发明内容

生物合成所得赛门苷I的纯化制备过程易受到细菌蛋白质和色素等杂质干扰，常规的大孔树脂吸附难以获得质量稳定的赛门苷I。因此，本发明针对蛋白质和色素的特征，系统考察蛋白质和色素去除方法后建立了一种操作简便，成本低，适合规模化应用的赛门苷I纯化制备新工艺。

本发明技术方案具体如下：

1)根据前期发明专利CN112063678A构建赛门苷I的生物合成体系；

2)考察活性炭在水溶液或乙醇/水混合溶液中对色素以及蛋白质的吸附情况；

3)考察非离子型大孔树脂在水溶液或乙醇/水混合溶液中对色素以及蛋白质的吸附情况；

4)考察煮沸除蛋白和乙醇沉淀去蛋白的效果；

5)考察阴离子型大孔树脂去除蛋白质和色素的效果；

6)根据工艺考察结果建立赛门苷I的最佳纯化制备工艺，并验证。具体为：

根据CN112063678A将赛门苷I的生物合成体系扩大至0.5～1L，反应完成后利用盐酸稀溶液将反应液体pH值5.0～5.5，煮沸或加入等体积乙醇，过滤除去沉淀物，用D101大孔树脂吸附除蛋白质，所得滤色用氢氧化钠溶液将滤液pH值调至7.0左右，然后采用D900大孔弱碱性阴离子交换树脂除去色素，所收集的洗脱液干燥后即得高质量赛门苷I。

或反应完成后利用盐酸稀溶液将反应液体pH值5.0～5.5，煮沸或加入等体积乙醇，过滤除去沉淀物，利用氢氧化钠溶液将滤液pH值调至7.0左右，然后采用D900大孔弱碱性阴离子交换树脂除去色素，所收集的洗脱液用D101大孔树脂二次吸附，40％乙醇水溶液等度洗脱，洗脱液干燥后即得高质量赛门苷I。本发明具有如下优点：

1)建立了一条从生物合成体系中规模化制备高质量赛门苷I的工艺，理论上可适用于其他种类罗汉果苷的纯化制备；