[发明专利]与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法

权利要求书

1.一种与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法，其特征在于，包括：

S1、通过NCBI检索鸡蛋主要过敏原的氨基酸序列；所述鸡蛋主要过敏原为6种蛋白，分别为：卵类黏蛋白、卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、α-卵黄蛋白、卵黄糖蛋白42；

S2、通过Uniprot工具手动输入牛乳的主要过敏原蛋白的氨基酸序列，通过Uniprot网页工具中的Align工具比对输入的过敏原与鸡蛋过敏原的序列相似性，预测是否存在交叉过敏原；若鸡蛋的某过敏原蛋白与该食物的过敏原蛋白之间存在任一80个以上氨基酸序列相似性≥30%，则预判该对过敏原蛋白存在交叉过敏；反之，则预判不存在交叉过敏；

所述牛乳的主要过敏原蛋白包括:α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白；

S3、在预判存在交叉过敏的情况下，通过DNAstar软件中的Protean工具预测存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原的二级结构及抗原表位；

该步骤具体方法为：采用BEPIPRED-1.0网络工具预测鸡蛋溶酶菌和α-卵黄蛋白的线性表位；将Protean工具预测的抗原表位的预测结果结合采用BEPIPRED-1.0网络工具预测的线性表位的预测结果，共同作为下一步分析确定交叉过敏原相似序列的基础；

S4、基于S3的预测结果，采用Blastp网页工具分析确定所述存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原和过敏原蛋白的相似序列；该步骤具体包括：

通过Blastp工具分析溶菌酶与α-乳白蛋白具有2条相似序列：溶菌酶氨基酸序列中的第56-71位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第55-69位；溶菌酶氨基酸序列中的第81-95位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第79-93位；

通过Blastp分析α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白有6条相似序列：依次为：α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第26-35位与血清白蛋白氨基酸序列的第24-32位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第80-94位与血清白蛋白氨基酸序列的第312-326位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第115-125位与血清白蛋白氨基酸序列的第112-122位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第323-335位与血清白蛋白氨基酸序列的第525-554位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第525-535位与血清白蛋白氨基酸序列的第520-530位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第560-570位与血清白蛋白氨基酸序列的第555-565位；

S5、根据S2预判的存在交叉过敏反应的蛋白，制备相应的单抗或多抗，应用免疫印迹法和ELISA方法识别交叉过敏原，进一步合成和纯化步骤S4所确定的所述相似序列，用血清学实验鉴定该相似序列是否为作用表位；该步骤具有包括：

（1）采用Fmoc固相肽合成法，将C-末端氨基酸连接到一种合适的固相载体上，采用Fmoc法进行逐步缩合，合成结束后，用强酸将序列从固相载体上切割下来，经HPLC纯化，冷冻干燥后备用；合成乳白蛋白的序列为Y₅₅DTQAIVQNNDSTEY₆₉和W₇₉CKDDQNPHSSNICN₉₃；合成血清白蛋白的序列为R₂₄DTHKSEIA₃₂，C₃₁₂IAEVEKDAIPENLP₃₂₆，A₁₁₂DCCEKQEPER₁₂₂，F₅₂₅DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE₅₅₄，Y₅₂₀VPKAFDEKLF₅₃₀和L₅₅₅LKHKPKATEE₅₆₅；

（2）依次通过间接ELISA鉴定上述8条相似序列是否与血清抗体发生免疫反应，最终确定溶菌酶交叉过敏原α-乳白蛋白线性序列为Y₅₅DTQAIVQNNDSTEY₆₉和W₇₉CKDDQNPHSSNICN₉₃；α-卵黄蛋白交叉过敏原牛血清白蛋白线性序列为C₃₁₂IAEVEKDAIPENLP₃₂₆、F₅₂₅DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE₅₅₄、Y₅₂₀VPKAFDEKLF₅₃₀和L₅₅₅LKHKPKATEE₅₆₅。

2.根据权利要求1所述的确定方法，其特征在于，S2中，通过比对确定鸡蛋中的溶菌酶与牛乳中的α-乳白蛋白序列相似性为34.459%，鸡蛋中的α-卵黄蛋白与牛乳中的血清白蛋白序列相似性为44.065%；预判溶菌酶与α-乳白蛋，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白存在交叉过敏。