[发明专利]一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法

说明书

本发明公开了一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法，该方法适用于含有以上三个抗性基因中至少一个的转基因植株；要求将待测转基因植株与公共竞争株系BHK^‑1进行杂交，保证所有经过抗生素筛选的F1植株的二倍体基因组组成由一个来自BHK^‑的单倍体基因组和另一个来自转基因植株的单倍体基因组组成。将这些F1植株的基因组DNA通过竞争型PCR扩增后，就可以很容易地根据PCR产物的灰度比来判断转基因植株是否含有单一的T‑DNA拷贝。本发明操作简单、重复性高，可以作为Southern blot的替代方法来检测转基因植株中T‑DNA插入的单个拷贝。

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，尤其涉及一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法。

背景技术

突变基因的数量与宿主染色体上插入的T-DNA数量密切相关。Southern blot分析能够通过杂交信号带检测T-DNA插入的单个拷贝[Southern,1975]。Southern blot分析包含多个实验步骤，如基因组的提取和消化、琼脂糖凝胶电泳、膜转移和杂交，这一系列使该实验变得非常复杂[Southern,1975]。特别是在杂交中，需要一种能退火到靶上的标记探针。目前，探针制备主要采用同位素法和地高辛法两种方法。同位素标记探针使杂交信号的可视化相对简单，但由于其放射性，实验人员必须考虑同位素污染。为此，开发了地高辛标记探针[Martin et al.,1990；Solanas and Escrich,1997]。虽然地高辛是安全的，但是地高辛标记的探针后续还需使用免疫亲和法，使得杂交信号的可视化变得更加复杂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法，该方法基于竞争型PCR和单拷贝通用竞争子BHK^-1，包括以下步骤：

(1)将待测转基因植株与通用竞争转基因植株BHK^-1进行杂交，保证所有经过抗生素筛选的F1植株的二倍体基因组组成由一个来自BHK^-的单倍体基因组和另一个来自转基因植株的单倍体基因组组成；

(2)将这些F1植株的基因组DNA通过竞争型PCR扩增后，根据PCR产物的灰度比来判断转基因植株是否含有单一的T-DNA拷贝。

进一步地，所述转基因植株含有以上三个抗性基因中至少一个。

进一步地，所述植株为拟南芥。

本发明的有益效果是：相比于Southern blot的复杂性且高污染性，本发明方法本质上是基于定量分析，只需要PCR扩增；所获实验结果中单个的比率与平均比率几乎一致，表明其一致性强且稳定可信、可重复性较高；本发明操作简单且易于掌握，可以很好地代替Southern blot用来鉴定转基因植株是否含有单拷贝。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测seb19-L中ProHTR10拷贝与GFP拷贝的比值示意图；其中，A包括seb19-L(品系1)T-DNA整合位点、野生型植物5号染色体(品系2)的相应片段、1号染色体(品系3)中HTR10启动子(ProHTR10)以及质粒pGreen-ProHTR10:GFP(品系4)部分结构；B为杂合子植物seb19-L PCR鉴定；C为ProHTR10拷贝与GFP拷贝的三组实验比值；

图2为评估质粒DMGDG和2×DMGDG竞争型PCR的敏感性示意图；其中，A包括片段DMG、DG、DMGDG、2×DMGDG结构；B为5组单独以质粒DMGDG和2×DMGDG为模板产物灰度比值(上、下限)；