[发明专利]一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法有效
| 申请号： | 202110530249.3 | 申请日： | 2021-05-14 |
| 公开（公告）号： | CN113293102B | 公开（公告）日： | 2023-07-14 |
| 发明（设计）人： | 李辉;尹涛;杨雪珊 | 申请（专利权）人： | 深圳大学 |
| 主分类号： | C12N1/12 | 分类号： | C12N1/12;C12N15/10;C12R1/89 |
| 代理公司： | 北京三聚阳光知识产权代理有限公司 11250 | 代理人： | 安志娇 |
| 地址： | 518000 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 叶绿体 以及 rna 提取 方法 | ||
1.一种衣藻叶绿体RNA提取的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)取待提取衣藻细胞消化细胞壁，得到悬浮液1；
(2)将悬浮液1 中原生质体富集；
(3)将原生质体破碎后分离叶绿体；破坏叶绿体外膜的具体方法为：加入Digitonin，置于2-6℃，消化10-15min；Digitonin的加入量为100μg的叶绿体蛋白加入4μg-8μg的Digitonin；
(4)加入RNase A，收集沉淀，获得无胞质RNA污染的叶绿体；利用商用总RNA试剂盒提取无胞质RNA污染的叶绿体中的叶绿体RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中的消化细胞壁的方法为：将待提取衣藻细胞悬浮于细胞壁酶解缓冲液中，消化的条件为：23-25℃下，避光10min以上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括终止消化细胞壁的步骤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中终止消化细胞壁的方法为在悬浮液1中加入酶解终止缓冲液。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）还包括将所得原生质体用原生质体等渗缓冲液重悬浮，得悬浮液2。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤（3）中将原生质体破碎的方法为：
S1:将悬浮液2离心，收集细胞沉淀；
S2：将所得沉淀用原生质体破碎缓冲液重悬浮后，获得的悬浮液3利用尼龙筛过滤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述尼龙筛孔径为10μm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，从悬浮液3中分离叶绿体的方法为Percoll液密度梯度离心。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，密度梯度离心结束后，取出墨绿色条带，用缓冲液A稀释，离心，收集沉淀，获得叶绿体粗提取物，将该叶绿体粗提取物重悬浮于所述缓冲液A中，得到悬浮液4；所述缓冲液A为：330mM 山梨醇和50mM HEPES-KOH，pH为7.3。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将悬浮液4中的叶绿体破坏叶绿体外膜后加入缓冲液A稀释，终止叶绿体外膜的破坏，得到悬浮液5。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，向悬浮液5中加入RNase A，收集沉淀，获得无胞质RNA污染的叶绿体。
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