[发明专利]单个转录因子诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞的方法

说明书

本发明涉及单个转录因子诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞的方法，属于干细胞生物学及再生医学领域。体外合成转录因子NR5A1的化学修饰性mRNA，利用患者自体尿液中提取的外泌体作为递送载体，形成外泌体‑modNR5A1复合物，然后与患者自体组织来源的ADMSCs共培养，以诱导其分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞。通过本发明方法，不仅能够快速、高效的获取具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，同时该细胞能够对黄体生成素的刺激做出有效反应，而且具有成熟Leydig细胞雄激素合成相关的基因表达谱。利用本发明获取的Leydig细胞在男性性腺功能低下症的治疗方面，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于干细胞生物学及再生医学领域，涉及一种使人脂肪来源的间充质干细胞定向分化为具有睾酮分泌功能的睾丸间质样细胞的方法。

背景技术

睾丸间质（Leydig）细胞数量占整个睾丸细胞的3～5%，但其分泌的睾酮却占体内睾酮的90%以上。其结构受损或功能障碍是造成男性雄激素分泌不足的主因。临床上主要采用雄激素替代疗法，但长期补充雄激素会导致诸多并发症，如：精子发生异常、诱发心血管事件、增加罹患前列腺癌等风险。另外，单纯的药物疗法很难模拟体内正常雄激素水平的生理性变化。研究表明，通过移植具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，可以明显升高血清睾酮水平，且睾酮分泌呈现一定的节律性。显然，这种优势是雄激素药物所不具备的。

目前，获取Leydig样细胞的途径及方式均存在一定缺陷。传统的方法诱导干细胞分化，存在诱导时间长，诱导效率低下及伦理等问题；此外，采用病毒介导的转基因方式虽然快速、高效，但存在基因组整合致细胞癌变风险，无法应用于临床。为了解决这种窘况，迫切需要探索一种安全、快速、高效地获取Leydig样细胞的新策略。

在不同组织来源的间充质干细胞中，ADMSCs具有来源广，易获得性，可取自患者本人，能有效避免免疫排斥及伦理等问题，是一类最具应用潜力的间充质干细胞。近来，我们发现只需通过慢病毒过表达NR5A1基因（类固醇形成因子1基因），即可快速、高效实现人源ADMSCs分化为Leydig样细胞。由于其没有摆脱转基因的风险，同样无法应用临床。

研究表明，体外合成的化学修饰性mRNA（Chemically synthetic modified mRNA,modRNA）能在受体细胞内快速、高效表达目的因子，进而诱导细胞定向分化；如：神经细胞、血管内皮细胞及心肌细胞等，这充分表明modRNA同样具有传统转基因所具备的特性。重要的是，其不会带来转基因潜在的致突变等风险。如果能采用一种安全、高效的方式向自体ADMSCs导入特定的modRNA，诱导其定向分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，则解决了临床移植所面临的种子细胞缺乏，同时避免细胞移植带来的免疫排斥问题。这是临床转化前迫切解决的问题。但是，目前还没有一种同时具备“安全、快速、高效”地获取具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞的相关报道。

发明内容

为了解决现有干细胞诱导分化为Leydig样细胞的技术无法同时兼顾“安全、快速及高效”的问题，本发明提供一种新的体外诱导人源ADMSCs向Leydig样细胞分化的方法，通过体外合成转录因子NR5A1的modRNA（即modNR5A1），利用人尿源性外泌体（exosomes）作为递送分子的载体，诱导自体ADMSCs分化为Leydig样细胞，从而为男性性腺功能减退症（雄激素缺乏症）的临床治疗提供一种新的思路和方法。

本发明采用的具体方案如下：

本发明的目的一是提供一种诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞的方法，所述方法是在体外合成转录因子NR5A1的化学修饰性mRNA，即modNR5A1，利用患者自体尿液中提取的外泌体作为递送化学修饰性mRNA的天然载体，形成Exo-modNR5A1复合物，然后，将所述Exo-modNR5A1与患者自体组织来源的脂肪间充质干细胞共培养，诱导其分化为具有睾酮分泌功能的睾丸间质样细胞。

进一步地，所述方法的具体步骤如下：