[发明专利]一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用

权利要求书

1.一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，将酰基高丝氨酸内酯酶编码基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，去掉载体上调控蛋白编码基因lacI，再转入枯草芽孢杆菌，得到具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体以pHT01基础，去除其表达调控蛋白的编码基因lacI，使其能够在不添加诱导剂的条件下，在枯草芽孢杆菌中高效表达。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酰基高丝氨酸内酯酶能够有效水解酰基高丝氨酸内酯类信号分子。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建包括下步骤：

（1）将编码酰基高丝氨酸内酯酶的ahlX基因克隆到质粒pHT01中的BamH I和Xba I限制性酶切位点中；

（2）通过反向PCR方法扩增质粒DNA，删除质粒pHT01上的调控区域基因lacI，构建表达载体。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168为宿主菌。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据ahlX的DNA序列（SEQ NO.1）设计上下游引物，上游引物F-A1：CGCGGATCCATGGCCGCTCCACGTCTCTATAT（SEQ No.2）；下游引物R-A2：TGCTCTAGATCAAGCGTAGTATTCCGGGGCGT（SEQ No.3）从pET28-ahlX中扩增，获得目的片段ahlX；

（2）SanPrep柱式质粒DNA小量抽提质粒pHT01；

（3）BamH I，Xba I分别双酶切质粒pHT01和目的片段ahlX基因，纯化后用T4连接酶进行连接，热激法转化大肠杆菌E. coli DH5α，挑取转化菌落测序验证，得到重组质粒pHT01(Pgrac)-ahlX；

（4）抽提pHT01(Pgrac)-ahlX，电转入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到BSAHLX01菌株，即为具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为不同启动子的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述启动子包括PgsiB、PaprE、PamyE、PamyQ、PsacB、PsrfA、PxylA、Phoiln、Phpall、Pshuttle-09和P43。

9.一种如权利要求1-8任一所述的构建方法得到的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵过程中，不需要额外添加诱导剂就能够组成型表达高活性酰基高丝氨酸内酯酶。

10.一种如权利要求9所述的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌在防治胡萝卜软腐欧文氏菌所导致的植物软腐病中的应用。