[发明专利]一种非洲猪瘟病毒核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R、CD2v基因的核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物，其特征在于，由B646L基因的上游引物B646L-F、下游引物B646L-R和探针B646L-P；MGF505-2R基因的上游引物MGF505-2R-F、下游引物MGF505-2R-R和探针MGF505-2R-P；CD2v基因的上游引物CD2v-F、下游引物CD2v-R和探针CD2v-P组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物B646L-F：GGGTGCATGTCATTCATCCT；

下游引物B646L-R：GTCATATCCGTTGCGAGGAA；

探针B646L-P：FAM-AGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCA-BHQ1；

上游引物MGF505-2R-F：AGCTCTTGTTACTGTGGAAGG；

下游引物MGF505-2R-R：AAAACGTTCTAAAGCGTGGC；

探针MGF505-2R-P：VIC-ACGCCGTCATAGGAGCCTTGCAGGGTGA-BHQ1。

上游引物CD2v-F：AGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAA

下游引物CD2v-R：TCATGTATGGAAGTGGTGTCATCA

探针CD2v-P：CY5-CTAATGAAGAAGAACAATGTC-MGB。

2.一种包含权利要求1所述的检测组合物的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，由试剂A、试剂B、试剂C和试剂D组成；试剂A为核酸释放剂；试剂B为荧光定量PCR反应液，包含探针法荧光定量试剂Premix Ex Taq^TM、内参染料ROX Reference Dye II、权利要求1所述的B646L、MGF505-2R和CD2v基因的三组引物和探针和无菌无酶水；试剂C为阳性对照，包含标准质粒pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v；试剂D为阴性对照，为无菌无酶水。

4.如权利要求3所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒pUC57-B646L，浓度为2.6×10⁴拷贝/微升；标准质粒pUC57-MGF505-2R，浓度为2.8×10⁴拷贝/微升；标准质粒pUC57-CD2v，浓度为3.2×10⁴拷贝/微升。

5.如权利要求3所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A核酸释放剂用于口腔液、鼻拭子和血液样本核酸的提取，提取具体方法为：将样品以5000rpm的速度离心3分钟；离心后，取40μL上清，加入10μL核酸释放剂，99℃作用10分钟；再以5000rpm的速度离心3分钟，所得上清即为待测样品的DNA模板。

6.一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA模板；

(2)采用权利要求1所述的检测组合物建立三重荧光定量PCR反应体系；

(3)进行荧光定量PCR检测；

(4)待测样品的结果分析。

7.如权利要求6所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR反应体系为25μL，包含20μL的试剂B和5μL的模板；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照或阴性对照。

8.如权利要求7所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述20μL的试剂B包括探针法qPCR反应预混试剂Premix Ex Taq 12.5μL、内参染料ROX Reference Dye II 0.25μL、权利要求1所述的B646L、MGF505-2R和CD2v基因的每种引物和探针的反应终浓度均为0.1μM，余量为无菌无酶水。

9.如权利要求8所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。