[发明专利]一种用于检测乙型流感病毒的LAMP引物、探针、试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测乙型流感病毒的LAMP引物、探针、试剂盒。所述引物探针组合产品包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物LF、LB和探针。本发明提供的试剂盒用于乙型流感病毒病毒RNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为乙型流感病毒病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测乙型流感病毒的LAMP引物、探针、试剂盒。

背景技术

流行性感冒病毒（Influenza virus）包括人流感病毒和动物流感病毒。其中人流感病毒分为甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）三种。乙型流感病毒无亚型，根据HA的抗原性分为Victoria和Yamagata系。在自然情况下，乙型流感病毒一般仅感染人，呈现散发、爆发或小流行的态势，常引起局限性流行。

流感病毒的检测方法较多，可分为：（1）病毒分离、电镜检测。该方法耗时长、复杂且对仪器和场地要求高；（2）血清型检测和抗原检测。该方法虽然简单、耗时多，但灵敏度不高且假阳性高；（3）核酸检测，如荧光定量PCR、NGS和等温扩增等方法。核酸检测可兼顾灵敏度和特异性，其中具体包括：1)荧光定量PCR及QF-PCR方法。该检测方法的检测时间中等，集中检测通量适宜，但是其检测流程复杂、检测仪器成本高、对检测人员和环境要求高，大多适宜中心医院进行集约化检测；2）NGS方法，如mNGS。该方法既可以识别病原体的基因组序列及其突变，也可实现对病毒溯源和流行病学追踪；但其检测周期最长，成本高昂，对实验环境和人员要求最高。3）等温扩增方法。该方法可以采用单一温度扩增，无需仪器进行复杂的温度变化控制，装机成本大大降低，操作简便，适宜在基层医院、防控现场以及家庭的使用

与qPCR这种最常见检测方法相比，现有的恒温扩增技术，如LAMP或RPA等技术的灵敏度、特异性仍有不足，限制其在病原体检测应用和推广。现有技术中，大多基于QPCR方法进行检测，无满足基层医院或防控现场以及家庭自测等需求。而等温技术中，专利申请公开号为CN 109797245A和CN 107893130A公布了基于RPA技术检测乙型流感病毒的引物、探针和试剂盒，但RPA系统的酶类复杂、扩增不稳定、开盖巢式PCR容易产生假阳性；专利申请公开号为CN 112195275A采用SYBRgreen染料-LAMP技术检测乙型流感病毒，但染料法其特异性不高，容易产生假阳性。

基于此，本发明开发一种特异性强、操作简便的检测方法，具体为基于LAMP技术的探针法检测乙型流感病毒的引物、探针和试剂盒。

发明内容

本发明的第一方面涉及引物探针组合，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物LF和LB和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1~4所示；

环引物LF和LB的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其中，探针5’端第10位核苷酸为核糖核苷酸。

本发明的第二方面涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合产品。

本发明的第三方面涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于检测乙型流感病毒的诊断试剂或试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明提供的试剂盒用于乙型流感病毒病毒RNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为乙型流感病毒病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

2）本发明提供的试剂盒采用核糖核酸酶HII报告系统，与恒温扩增同步反应，在55~65℃条件下均可实现靶基因的有效扩增及检测，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，10-40min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为500 copies/mL。