[发明专利]一种同时区分羟基自由基和过氧化氢的双功能荧光探针的合成与应用

权利要求书

1.一种同时区分羟基自由基和过氧化氢的双功能荧光探针，其特征在于，所述的双功能荧光探针的化学结构式如所示：

2.如权利要求1所述的双功能荧光探针的合成方法 ，其特征在于，所述双功能荧光探针的合成方法包括以下步骤：

步骤1.合成3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯

a.将适量3-氟-4-硝基苯甲醚与L-脯氨酸甲酯盐酸盐加入无水乙腈中，再加入适量的三乙胺加热回流反应6小时，过滤除去三乙胺盐酸盐，旋干溶液，

b.将旋干后的溶液用甲醇溶解，缓慢加入适量的氯化铵和锌粉，室温下搅拌过夜，然后过滤除去锌粉，旋干溶剂，所得固体加入水中，过滤干燥得绿色固体，

c.将绿色固体用无水四氢呋喃溶解，加入适量硼氢化钠和三氟化硼乙醚，90℃下反应12小时，反应完全后，缓慢倒入水中，用氢氧化钠调节溶液pH至12，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将有机层旋干，

d.将上述产品加入适量的丙烯酸甲酯和冰醋酸中回流反应6小时，过滤得到3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯；

步骤2.合成3-(7-甲酰基-8-羟基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯

I.在氮气保护条件下，将适量干燥重蒸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)缓慢加入等体积的三氯氧磷(POCl₃)中，在20-50℃下搅拌30-60分钟，将3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯溶于适量DMF中，逐滴加入到上述混合溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时；反应完全之后，将反应液倒入适量冰水中，用20％的NaOH溶液调节pH至5～6，然后用乙酸乙酯萃取，有机层旋干，得黄色液体产物，

II.将适量的铝和碘加入无水乙腈中，反应10分钟，将上述黄色液体溶入适量无水乙腈中，滴加至铝和碘的乙腈溶液中，回流反应6小时，反应完全后，反应液加入冰水中，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，旋干，柱层析纯化得3-(7-甲酰基-8- 羟基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯；

步骤3.合成双功能荧光探针甲基3-(7-(2,2-二氰基乙烯基)-8-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苄基)氧基)-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸酯

i.将3-(7-甲酰基-8-羟基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯和4-溴苯硼酸频哪醇酯加入适量乙腈中，再加入适量碳酸钾，回流过夜，反应完毕后柱层析纯化得黄色固体，

ii.将步骤i中黄色固体和丙二腈加入适量乙醇中，再加入适量哌啶，室温下搅拌反应过夜，过滤得到所述的双功能荧光探针3-(7-(2,2-二氰基乙烯基)-8-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苄基)氧基)-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸酯。

3.如权利要求2所述的双功能荧光 探针的合成方法，其特征在于，所述步骤i的3-(7-甲酰基-8-羟基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)丙酸甲酯和4-溴苯硼酸频哪醇酯摩尔比为1:2。

4.如权利要求1所述的双功能荧光探针的应用，其特征在于，所述的双功能荧光探针制备在环境中定量分析羟基自由基和过氧化氢，在活细胞中同时区分荧光成像羟基自由基和过氧化氢的器件的应用。