[发明专利]土壤中大丽轮枝菌微菌核的检测方法及培养基及制备方法

说明书

本发明公开了土壤中大丽轮枝菌微菌核的检测方法及培养基及制备方法，其中，检测方法包括：(1)取土样并进行无菌处理；(2)配制大丽轮枝菌微菌核培养基；(3)利用采样器‑干筛法分离微菌核装置采集土样；(4)采集的土样进行大丽轮枝菌微菌核培养；(5)对培养后土样中大丽轮枝菌微菌核进行计数。大丽轮枝菌微菌核培养基包括PartⅠ培养基、PartⅡ培养基和PartⅢ培养基；配制PartⅠ培养基、PartⅡ培养基和PartⅢ培养基，然后将PartⅠ培养基和PartⅡ培养基灭菌后加入PartⅢ培养基中混合均匀制备得到大丽轮枝菌微菌核培养基；本发明检测方法可快速准确检测不同地块大丽轮枝菌微菌核的含量。

技术领域：

本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及土壤中大丽轮枝菌微菌核的检测方法及培养基及制备方法。

背景技术：

向日葵黄萎病的病原菌是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的，属于半知菌亚门真菌。大丽轮枝菌寄主范围广泛，可危害200多种植物，包括多种农作物、景观植物、果树和一年或多年生牧草，并且其寄主范围仍在扩大。该菌菌丝体呈明显轮枝状，有分隔，老熟时加粗变褐，后期产生黑色微菌核。微菌核是病原菌在土壤中主要的休眠结构，抵抗不良环境能力强，是土壤中病原菌长期存活及初侵染的主要形式。因为其为病害的初侵染源，微菌核的数量及存活状态决定着黄萎病的发生严重程度。

目前，土壤中黄萎病菌微菌核定量检测方法多而复杂，最为常规的检测方法为土壤稀释梯度分离法，该方法操作复杂、实验周期长并且易受主观判断影响。利用分子检测对精细度要求较高且代表性不强。用湿筛法和果胶盐选择性培养基可定量分析土壤中大丽轮枝菌的定殖情况，但对微菌核含量较少的土壤检测能力弱。而后大量研究人员通过选择用选择性培养基分离培养微菌核，虽然可定量分析土壤中大丽轮枝菌的定殖情况，但对微菌核含量较少的土壤检测能力弱，对镰刀菌等杂菌抑制效果差，且培养基成分复杂且难以进行观察和统计。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一种快速、准确、操作简单的土壤中大丽轮枝菌微菌核的检测方法。

本发明的第二个目的在于提供一种对大丽轮枝菌微菌核具有良好选择性的大丽轮枝菌微菌核培养基。

本发明的第三个目的在于提供一种对大丽轮枝菌微菌核具有良好选择性的大丽轮枝菌微菌核培养基的制备方法。

本发明的第一个目的由如下技术方案实施：土壤中大丽轮枝菌微菌核的检测方法，其包括如下步骤：

(1)取土样并进行无菌处理；

(2)配制大丽轮枝菌微菌核培养基：按照大丽轮枝菌微菌核培养基中各组分比例分别配制PartⅠ培养基、PartⅡ培养基和PartⅢ培养基，然后将配制好的PartⅠ培养基和PartⅡ培养基分别经121℃灭菌15～20min，并降温至50～56℃后加入PartⅢ培养基中混合均匀制备得到大丽轮枝菌微菌核培养基；本发明培养基相对于现有同类型培养基的具有明显的杂菌抑制效果，且成分较为简单，操作简便，易于观察。

(3)利用采样器-干筛法分离微菌核装置采集土样：培养皿中放入配制好的大丽轮枝菌微菌核培养基，然后将培养皿放入采样器-干筛法分离微菌核装置的微生物采样器中，启动采样器-干筛法分离微菌核装置，并将采样器-干筛法分离微菌核装置的压强调至-0.08～-0.06MPa，称量土样，并将称取的土样快速倒入微生物采样器顶端入口中，封住微生物采样器顶端入口5-10s，土样会均匀平铺在培养皿中；采样器-干筛法分离微菌核装置停止运行，取出培养皿；在本发明设定的压力范围内，能够保证土样在培养皿中均匀分布。

(4)采集的土样进行大丽轮枝菌微菌核培养；

(5)对培养后土样中大丽轮枝菌微菌核进行计数。

进一步，所述PartⅠ培养基为每500mL蒸馏水中添加5g Polygalacturonic Acid(聚半乳糖醛酸)(P-3889，SIGMA公司)和1.4g NaOH；