[发明专利]一种多重巢式PCR方法

权利要求书

1.一种多重巢式PCR方法，其特征在于，包括含4种目的基因C C2orf43、GPR132、RP11-405A12.2以及一个基因间区域的引物组；引物组包括内侧引物和外侧引物，其中内侧引物序列包含二代测序接头序列；

外侧引物的核酸序列包括：

1-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGCAAAGAGTCAGTG；

2-PCR-NGS-F1：TTCCCTTTGGCAGAGGCAGCAG；

3-PCR-NGS-F1：TTTGGTTGGAAGAGGAGGCT；

4-4-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGGAAAGAGTCAGTG；

R-short：CAAGCAGAAGACGGCATACGA；

内侧引物的核酸序列包括：

P5-1-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCTTCCACTGGCTTCAGGACTGACGCC；

P5-2-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGGCTTCAGCCCATGGAGCGGGTAG；

P5-3-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAACCGGTAGGCTCTATAGAAATAGCAGCA；

P5-4-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTTGTAGCAGCAGGAGGCCCGGTG；

R-short：CAAGCAGAAGACGGCATACGA。

2.根据权利要求1所述的一种多重巢式PCR方法，其特征在于，步骤如下：

a1、提取血浆游离DNA；

a2、将cfDNA片段进行末端修复并补齐；

a3、将末端补齐的DNA与短接头进行连接，得到连接产物；

a4、将N3(叠氮)修饰葡萄糖基团转移至5hmC,然后采用点击化学的方法捕获含有糖基化修饰的序列；

a5、依次采用外侧引物组合和内侧引物组合进行两轮PCR扩增后，进行低深度二代测序检测。

3.一种包括权利要求1-2任一项所述的多重巢式PCR方法的应用，其特征在于，应用于肝癌早期诊断，诊断步骤如下：

b1、血浆游离DNA提取：取受试者血浆2ml提取得到DNA溶液50μL；

b2、对提取的cfDNA片段进行末端修复并补齐；

b3、将短接头连接至末端补齐的DNA；

b4、通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

b5、在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇；

b6、将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉亲和素免疫磁珠上；

b7、利用缓冲液多次洗涤固相材料去除未结合的DNA片段；

b8、以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，依次采用外侧引物组合和内侧引物组合引物组，进行两轮PCR扩增；

b9、用1.5x的AmpureXP beads纯化扩增产物，获得最终测序文库；

b10、使用Qubit对获得的测序文库进行浓度测定，并使用LabChip GX Touch对文库DNA片段大小含量进行确定，将文库按相同浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序。

4.根据权利要求3所述的一种多重巢式PCR方法的应用。