[发明专利]一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法

说明书

本发明提供了一种用HPLC‑ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，包括以下步骤：制备庆大霉素对照品溶液、发酵液样品处理、绘制标准曲线、应用HPLC‑ELSD检测、用标准曲线法计算样品中庆大霉素含量及组分。本发明的有益效果为：本方法样品处理步骤简单，无需采用衍生化反应或树脂吸附，检测更加方便及时；检测专属性高、分离效果好，能有效识别样品中庆大霉素各组分的色谱峰；检测结果准确度高，各组分加标回收率平均值为99.3％‑101.6％；重复性和耐用性好，相对标准偏差均小于2％；该方法能同时测得药典中关注的庆大霉素总含量和各组分比例。

技术领域

本发明属于成分检测领域，涉及检测庆大霉素含量及组分的方法，具体的涉及一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法。

背景技术

庆大霉素[Gentamicin，正泰霉素(gentamycin)]系从放线菌科单孢子属发酵培养液中提得的多组分混合物，包括C₁、C₂、C_1a、C_2a四个主要组分和C_2b、西索米星、庆大霉素B等多个次要组分，是常用的氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗细菌感染。庆大霉素是目前临床用于抗各种革兰阴性菌感染的主要抗生素之一，而且是为数不多的热稳定性的抗生素，因而在国内外得到广泛应用。发酵生产庆大霉素的企业也很多。

由于庆大霉素组分较多，有关物质多而复杂，且不同成分的生物效价和生物毒性不同，如C_1a及C₂疗效高，但C₂的毒性较大，且易产生耐药性，而C₁毒副作用较小、不易产生耐药性，但疗效不如C₂及C_1a，所以各国药典对庆大霉素中各组分和有关物质的含量、比例都有严格的规定。

研究试验表明，提取过程树脂吸附对于料液中各组分的比例影响不大，如果发酵液料液中组分比例不合格，则提取过程中需要丢弃较多的料液以保证成品组分合格，所以若在发酵生产过程中就将料液中各组分的比例调控至合格或接近合格，则事半功倍，降低成本。因此含量及组分检测对于庆大霉素的发酵生产过程控制具有重要意义。

然而目前药典和文献报道的庆大霉素的检测方法多是用于原料药、成品(注射液、片剂、胶囊、眼药水)或半成品等样品的检测，包括微生物检定法、液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)、液相色谱-脉冲安培电化学检测法(HPLC-PAD)、离子色谱-脉冲安培电化学检测法(IC-PAD)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、核磁共振法(NMR)、酶联免疫法(ELISA)、旋光法等，还有一些报道是用于庆大霉素残留限量检测的免疫试剂盒或试纸条法，而用于庆大霉素发酵样品检测的只有分光光度法(《紫外分光光度法快速测定庆大霉素发酵液中庆大霉素浓度及其机理》)和薄层色谱法。

分光光度法因为庆大霉素本身没有紫外吸收，检测过程需要衍生或加酸加热水解后间接测定，操作繁琐，费时费力，干扰因素多，准确度和专属性较差，且最后只能得到庆大霉素所有相关组分及同类杂质的总和，指征不明确；薄层色谱法能在一定程度上对主要组分进行分离，但操作繁琐，重现性和定量准确性差，仍不能准确指征各组分含量。