[发明专利]BN2基因及其在植物中的应用

说明书

本发明提供了一种BN2基因及其在植物中的应用。提供了BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。植物体内敲除BN2基因后会显著降低植物体内RNA沉默通路，使得植物对病毒更敏感；BN2基因能够显著促进植物体内RNA沉默信号通路；而且bn2基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高，从而可以用来在植物体内过表达蛋白或者应用于植物抗病育种领域。

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种BN2基因及其在植物中的应用，尤其涉及BN2基因在植物抗病育种领域中的用途。

背景技术

棉花曲叶病(Cotton Leaf Curl Disease，CLCuD)是棉花生产种植过程中最具爆发性和毁灭性病害之一，该病是由烟粉風传播的棉花曲叶病毒侵染所致。此病害因1988年在巴基斯坦的木尔坦(Multan)地区大爆发而闻名，随后此病迅速传播至其他国家和地区。由于棉花对该病抗性极低，一旦侵染将会造成棉花的减产甚至绝产，目前棉花曲叶病对整个巴基斯坦、印度及东亚和南亚的棉花生产来说都是最严峻的威胁和挑战(Briddon andMarkham,2000)。

截至目前的报道，能引起棉花曲叶病的病毒有10种。其中木尔坦型棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)是其中发病范围最广、侵染力最强、造成危害最大的病毒(Briddon and Markham,2000)。CLCuMuV可以侵染棉花、黄秋葵、朱槿、垂花悬铃花等多种寄主作物，并且能实现植株间交叉传染。CLCuMuV侵染后的棉花病株叶片皱缩、向下或向上卷曲，叶脉增厚、膨大，叶背而出现耳状突起，植株矮化，棉花产量急剧降低(Fauquet et al.,2008；Mansoor et al.,2006；Sattar et al.,2013)(图1.2)。CLCuMuV属于单组份病毒，基因组含有DNA-A和DNA-β，DNA-β上只编码βC1蛋白。DNA-A可以单独侵染棉花，但病状微弱。DNA-A和DNA-β共同侵染时会诱导典型的棉花曲叶病症状(Sattar et al.,2013)。

RNA沉默(RNA silencing，RANi)是指真核生物通过小RNA(small RNA，sRNA)靶向基因mRNA从而调节基因的表达的机制。RNA沉默作为生物界保守的防御机制在动物和植物的发育、抗逆境胁迫等方面具有至关重要的作用(Brodersen et al.,2008；Chinnusamyand Zhu,2009；Heo and Kim,2009)。总体来说，当病毒进入宿主细胞后，便开始利用细胞的酶、底物以及细胞器进行自身自身遗传物质的复制，并转录翻译出病毒蛋白以加快病毒的扩增。而这些大量产生的mRNA、RNA片段会在RNA依赖的RNA合成酶(RNA-dependent RNA-polymerases，RDR)的作用下形成双链dsRNA然后双链dsRNA会被DCL家族蛋白(DICER-LIKE，DCL)和dsRNA结合蛋白(dsRNA binding proteins，DRB)所识别，然后被剪切成21–24nt大小的小RNA(包括siRNA、miRNA、tasiRNA等)，这些小RNA会进一步被ARGONAUTE(AGO)家族蛋白识别并结合，和其他蛋白一起形成“RNA诱导的沉默复合体”(RNA-induced silencingcomplexes，RISCs)。沉默复合体一方面能够结合到靶标mRNA上，从而剪切降解靶标mRNA，实现相关基因的沉默，另一方面RISC结构也可以通过影响染色体的甲基化状态，形成转录水平上的基因沉默(Bologna and Voinnet,2014；Meister and Tuschl,2004；Pumplin andVoinnet,2013；Qi et al.,2006；Zilberman et al.,2004)。按照发生的位置和作用机制，植物基因沉默主要分为两个部分，转录水平基因沉默(transcriptional gene silence，TGS)和转录后基因沉默(post transcriptional gene silence，PTGS)，两者在植物对双生病毒的抵抗过程中都起到重要的作用。

通过RNA沉默调控植物内基因表达，从而改善植物的性能，还需要进一步改进。