[发明专利]一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法

说明书

本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种不依赖PCR反应的短片段快速克隆方法。该方法包括：线性化载体、设计并合成两条部分互补的长链寡核苷酸序列、制备目的序列、同源重组、转化、筛选，获得重组载体等步骤。本申请中，发明人对现有重组反应中目的片段的制备方法进行了进一步改进，利用单链重组方式延长了插入序列的长度，并利用大肠杆菌的天然修复系统完成了双链补全，从而达到短片段快速克隆目的。该发明保留了现有重组方法简单快捷的技术特点，同时兼具了现有连接方法在连接长度方面的技术优势。可为重组质粒改造（例如酶切位点改造、蛋白表达标签的添加等）奠定良好的技术基础。

技术领域

本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种不依赖PCR反应的短片段快速克隆方法。

背景技术

基因克隆是基因研究的主要技术手段，通常需要借助于不同类型载体才能实现目的基因的克隆和表达。实际操作中，载体通常需要经过改造才能满足实验的需要，例如多克隆酶切位点的替换以及表达标签的添加或去除。这些改造往往只需要替换很短的片段就可以完成。

现有技术中，针对短片段（一般指100 bp以下片段）基因克隆时，依据是否依赖PCR反应，可以分为如下两类。

依赖PCR反应的方法：这种方法与长片段克隆的策略一样，首先设计含有酶切位点的引物序列，通过PCR反应扩增目的序列、并纯化回收目的片段，随后，利用T4连接酶或重组酶，将目的片段与预先处理后的线性化载体进行连接。这种方法的主要缺陷在于：操作繁琐、花费时间长：需要模板且PCR扩增后，需要凝胶电泳鉴定、纯化回收等操作。另一方面，由于短片段序列扩增后的回收效率较低，而且PCR反应会产生错配，因此后期需要挑选多个克隆排除突变的克隆，由此导致操作成本较高。

不依赖PCR的方法：又可分为重组和连接两种类型；如果是通过重组的方式，按照现行的技术要求，需要合成两个完全互补且两端含有载体同源臂序列的引物，与线性化载体进行重组反应。这种方法的优点是操作简单，但是主要缺陷是连接片段短。这种方式如果合成两条60 bp的寡核苷酸引物序列，插入长度最长只有30 bp。如果是通过连接的方式，需要设计一对部分重叠的寡核苷酸引物，退火后两端产生酶切位点，通过连接酶连接到载体中。这种方式如果合成两条60 bp的寡核苷酸引物，插入长度可达到56 bp。目前这种方法广泛应用于基因编辑载体sgRNA (small guide RNA) 的克隆和RNA干涉载体shRNA (shorthairpin RNA)的克隆。这种连接方法虽然可以保证连接长度，但是操作复杂费时。其主要原因在于合成的寡核苷酸片段的5’端一般为-OH，因此需要使用T4多聚核苷酸激酶将5’末端磷酸化后才能进行连接反应，另外还需要加热使多聚核苷酸激酶失活和随后的连接反应。

总之，基于实际质粒改造需要，结合短片段特点，有针对性的对相关克隆方法进行进一步改进，对于相关生物技术的发展具有十分重要的技术意义。

发明内容

鉴于长序列（一般值100 bp以上）DNA片段合成时间较长、价格成本较高现状，以及现有短片段克隆方法无法较好兼顾操作的便捷和更长的插入长度的技术局限，针对部分短片段序列克隆需要，在现有不依赖于PCR反应的重组方法基础上，本申请目的在于提供一种改进的不依赖于PCR反应的重组方法，从而为短片段的简单快速克隆、以及重组质粒改造奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法，具体步骤如下：

（一）制备线性化载体

对载体进行单酶切或双酶切，以使载体线性化；并回收、纯化酶切后线性化载体；

实际操作中，对载体优选采用双酶切方式进行线性化处理，以避免线性化后载体的自连；