[发明专利]一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法

说明书

本发明涉及到一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法，本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向鸡NHE1基因W38位氨基酸的sgRNA，之后转染带有sgRNA和Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒，利用CRISPR‑Cas9系统达到基因位点的精确敲除，通过药物筛选及亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源NHE1基因W38位敲除的细胞系。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法，具体为一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的精确敲除鸡 NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法。

背景技术

CRISPR-Cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统，用于对抗病毒的入侵和外源DNA。其中Ⅱ型CRISPR-Cas系统运用最为广泛，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白到靶序列上，在PAM序列上游3bp位置特异性剪切DNA 双链，造成DNA双链断裂(DSB，double strand break)，从而启动细胞内的DNA 损伤修复机制，导致修复后发生碱基缺失或插入，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的。目前该技术已经成熟的运用于真核细胞的基因组编辑中。

Na+/H+离子交换蛋白-1(Sodium/hydrogen exchanger 1，NHE1)是存在于细胞膜表面的离子转运泵蛋白家族的一员。NHE1具有维持细胞内pH值等内环境稳定以及调控宿主细胞的凋亡和增殖的重要功能，也是首个被鉴定的J亚群禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV-J)的细胞受体，该蛋白存在于所有真核细胞膜上。ALV-J的Env可特异性的结合鸡NHE1位于细胞外环-1 (Loop-1)的28-39位氨基酸，并以此介导ALV-J的入侵及感染，而对ALV-J 不易感的禽类NHE1的W38氨基酸存在变异或缺失。本研究通过CRISPR/Cas9技术，药物筛选后通过亚克隆的方法，成功获得鸡源NHE1基因W38位精确敲除的 DF-1细胞株delW38-NHE1，且发现delW38-NHE1细胞系能够有效封闭ALV-J的感染。本发明为探究NHE1基因W38氨基酸生物学功能，解析NHE1基因W38位点与ALV-J互作分子机制以及为构建抗ALV-J转基因鸡与抗病毒药物开发打下了基础，具有良好的应用研究价值。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种精确敲除鸡NHE1基因W38 位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、构建一种特异性靶向鸡NHE1基因W38位的sgRNA，所述的sgRNA位于鸡NHE1基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一；

步骤2)、准备一种用于靶向敲除鸡NHE1基因W38位的CRISPR-Cas9系统， CRISPR-Cas9系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡NHE1基因W38位的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列；CRISPR-Cas9 系统中，Cas9蛋白的编码序列与sgRNA的编码序列位于同一质粒上，所述的质粒为lentiCRISPR v2；

步骤3)、合成以pUC57为骨架，含有缺失NHE1基因W38位所需的供体质粒，并命名为：pUC57-delW38；

步骤4)、将步骤1)构建的特异性靶向敲除鸡NHE1基因W38位的sgRNA克隆至带有Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒，并将lentiCRISPR v2质粒与步骤3)构建的供体质粒pUC57-delW38共同转染至细胞中；