[发明专利]一种多酶级联制备2-苯乙醇的方法

说明书

本发明涉及属于基因工程和酶工程领域，本发明利用基因工程和定点突变的方法，将来源于近平滑假丝酵母（保藏号ATCC7330）的羰基还原酶进行表达，并开展定点突变，获得羰基还原酶的酶活力提高6倍的突变体A121N，为利用羰基还原酶或其突变体酶还原苯乙醛制备2‑苯乙醇提供了酶源。在此基础上，本发明以苯乙醛为原料，利用葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶耦合，原位再生辅酶NADPH，催化反应后采用超滤设备分离浓缩回收酶，可以实现酶回收5次以上，极大降低2‑苯乙醇的制备成本，在优化工艺下，管式反应转化率达到90%以上，间歇式反应转化率可达到80%以上。

技术领域

本发明属于涉及基因工程与酶工程领域，涉及一种多酶级联制备2-苯乙醇的方法。

背景技术

2-苯乙醇(又名β-苯乙醇)是一种玫瑰香型的风味物质，世界每年产量约10000吨。它是仅次于香兰素的第二大类重要的食品或化妆品或者香水中添加剂，用于调节饮料的风味和化妆品中的香味。能够抑制革兰氏阴性菌、球菌、杆菌以及部分真菌；它还是合成一些高附加值药物比如苯乙醇苷的底物，具有抗菌、抗肿瘤、强心等作用，苯乙醇还可以作为杀虫剂和新型生物燃料。因此2-苯乙醇低成本高效合成非常重要。

目前2-苯乙醇的合成主要有植物提取、化学合成和生物法合成三种方法。(1)提取法：2-苯乙醇可以在玫瑰花瓣中提取得到，但是成本过高，得率较低；(2)化学合成法主要以苯、环乙烷或苯甲醇、CO和H₂在催化剂的作用合成。但是化工合成的过程中会含有苯类以及乙烯类有毒有害物质，添加到食品中会对食品安全造成一定的威胁，因此生物合成2-苯乙醇的方式成为当今研究的热点；(3)生物法合成目前报道以微生物发酵合成为主。所用的微生物主要有香灰菌(CN202011414356.1)、酿酒酵母(CN201910098372.5、CN201310243384.5、CN200910049170.8、CN201710378178.3)、产甘油假丝酵母(CN201610256845.6)、重组酿酒酵母(CN202010933723.2、CN201910688005.0、重组大肠杆菌(CN201710256900.6、CN201010276491.3)、里氏木霉(CN201310482330.4)等但是研究表明高浓度的2-苯乙醇)对微生物细胞有一定的毒性，当2-苯乙醇含量超过2g/L的时候微生物生长受到不同程度的抑制，从而制约了这种利用微生物直接转化的方法的应用。因此随着酶工程和蛋白质工程技术的发展，直接利用酶进行催化转化的方法受到广泛关注。

目前直接利用酶来催化合成2-苯乙醇的专利尚未见报道。酶法合成具有很多优点，不会受到产物对微生物的抑制的技术瓶颈，同时通过利用平行反应进行辅酶NADPH原位再生，利用超滤技术回收利用酶，极大降低酶的成本，为酶法合成2-苯乙醇提供了保障。

发明内容

为解决上述技术问题，提供一种多酶级联制备2-苯乙醇的方法。

本发明的方案是：

技术路线如下：

本发明的主要方法如路线所示，以苯乙醛为原料，添加酶源1羰基还原酶或酶源2突变体酶A121N，在25-35℃、pH6-8条件下反应，添加利用葡萄糖脱氢酶进行还原型辅酶NADPH再生，采用管式反应连续生产或间歇式反应的分批制备，选用一定孔径的有机膜材料进行超滤，分离产物和酶，浓缩酶回收利用。渗透液经过减压蒸馏，收集2-苯乙醇。

本发明的技术方案如下：

1、酶源1：通过构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-cpcr，表达带有组氨酸标签的近平滑假丝酵母Candida parapsilosis(编号ATCC 7330)羰基还原酶CpCR基因，并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶CpCR进行分离纯化和酶学性质研究。重组酶CpCR的基因序列全长1 107bp，含有368个氨基酸，分子量在41kD左右，比酶活为20U/mg。用于催化反应的液态酶制剂酶活为剂酶活为10000U/L。