[发明专利]一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法

说明书

本发明公开了一种基于超灵敏磁弛豫时间免疫传感器的免疫分析方法，该方法以氨基化纳米磁颗粒作为磁信号探针，以聚多巴胺作为信号放大系统，与特异性免疫反应相结合，并基于辣根过氧化物酶催化盐酸多巴胺聚合形成聚多巴胺，成功实现了对检测对象的超灵敏检测，解决了传统磁弛豫时间传感器检测痕量小分子物质灵敏度低的难题，可用于食品中痕量危害因子(真菌毒素、抗生素等)、生物标志物等的快速、超灵敏检测。

技术领域

本发明属于检测分析领域，涉及一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法。

背景技术

现有的定量检测方法主要包括理化分析法和生物化学法。理化分析法样品前处理比较复杂，检测成本高，且需要专业技术人员操作仪器，不适合现场快速检测。生物化学法可分为微生物分析法和免疫分析法，其中微生物分析法在抗生素残留检测中经常使用，但是易受较多因素影响，不能准确定量。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、化学发光免疫分析法和胶体金免疫层析法等。ELISA操作相对简单、特异性好、检测成本低，但其灵敏度较低，不适用于痕量危害物质的检测。化学发光免疫分析法灵敏度高、检测时间短、安全性高，但是发光标记物发光时间短、稳定性较差、检测精度不高。胶体金免疫层析试纸条具有简单、快速、成本低、适合现场快速检测等优点，但其灵敏度比ELISA低且易受操作者影响，无法满足痕量危害物质检测的需要。因此，急需研发一种可检测痕量危害物质的检测方法。

磁弛豫时间传感器是一种典型的生物传感器，该传感器的基本原理是：以偶联有抗原或抗体的超顺纳米磁颗粒作为磁信号探针，通过抗原-抗体的特异性亲和反应，使体系中的磁颗粒状态或数量发生改变，进而引起周围水分子质子的横向弛豫时间(T₂)发生显著改变，由于T₂信号改变的程度与目标分子含量相关，通过T₂的改变量可间接得到目标分子的含量。目前，磁弛豫时间传感器由于具有前处理简单、快速、灵敏、无损、适于现场检测等优点，在食品安全和体外诊断领域得到了应用，但磁弛豫时间传感器最大的缺点是缺乏有效的信号放大系统，灵敏度偏低，难以检测复杂样品中痕量危害物质。

有效的信号放大系统是提高传统磁弛豫时间传感器的关键。聚多巴胺是一种类似贻贝黏附蛋白结构的黑色素，其由盐酸多巴胺单体聚合而成，具有良好的稳定性和生物相容性，其丰富的活性基团(邻苯二酚，胺和亚胺)可以与多种生物大分子结合。因此，本发明拟构建一种基于聚多巴胺信号放大的超灵敏磁弛豫时间免疫传感器，将其与免疫分析方法结合后应用于痕量物质的检测。

辣根过氧化物酶(HRP)是免疫分析中常用的标记酶之一，具有很高的催化活性。我们使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体进行免疫反应，以催化形成聚多巴胺。在碱性条件下，聚多巴胺独特的结构和活性基团可以通过迈克尔加成反应或席夫碱反应，与含有氨基的物质结合。我们使用氨基化纳米磁颗粒(NH₂-MNP₃₀)与聚多巴胺反应，聚多巴胺会使氨基化纳米磁颗粒由分散状态变为聚集状态或通过吸附作用，引起上清液中氨基化纳米磁颗粒的数量发生改变，导致其周围水分子中氢质子的运动状态亦随之改变，产生不同的横向弛豫时间。因此，通过免疫标记酶-辣根过氧化物酶可以将聚多巴胺和磁弛豫时间传感器有机结合起来，对传统磁弛豫时间传感器的读出信号进行放大，从而提高其检测灵敏度。相比于传统的磁弛豫时间传感器，基于聚多巴胺的磁弛豫时间免疫传感器灵敏度的提高主要得益于两个方面：(1)辣根过氧化物酶的高效催化作用：辣根过氧化物酶可以加速多巴胺的聚合，将其聚合速率提高约100倍，有利于提高方法的灵敏度；(2)聚多巴胺与纳米磁颗粒的结合能力更强，因此导致磁颗粒状态改变或者数量改变的效果更好，有利于提高方法的灵敏性：传统的磁弛豫免疫传感器是基于抗原-抗体作用导致的磁颗粒聚集引起的磁信号的改变，磁信号改变有限，而聚多巴胺可通过席夫碱反应或迈克尔加成反应与氨基化纳米磁颗粒结合，两者的结合是由共价键维持的，结合效率高，不易重新断开。

发明内容