[发明专利]酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在酿酒酵母菌株的基础上，转入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一种。本发明通过精准控制以上关键基因的转入，在酵母体内构建了一种全新的利用木质素或对香豆酸转化合成原儿茶酸的路径，实现了利用木质素单体及木质素合成原儿茶酸。实验表明，本发明基因工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物制备原儿茶酸，不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成原儿茶酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。

背景技术

原儿茶酸作为药物，在临床上可用于治疗慢性气管炎、烧伤、小儿肺炎、菌痢、急性盂肾炎、急性胰腺炎及某种溃疡病的治疗。另外，其具有一定的抗氧化抗菌作用，对金黄葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌等有抑制作用。原儿茶酸是一种关键的代谢中间体，可以进一步转化为许多化学物质，如己二酸，吡啶2,4-二羧酸等。此外，在最近的研究中，原儿茶酸可以用做合成聚合物的单体。因此原儿茶酸具有广阔的应用前景，化学合成主要以香兰素为原料，经碱熔溶氧化脱甲基，再经酸化制备，该工艺需要240℃以上高温，反应大部分时间为固相反应，难于控制，必须使用特殊的反应设备，投资大、设备利用率低。微生物转化合成原儿茶酸技术，已经进行了开发研究。原儿茶酸主要通过3-脱氢莽草酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，aroZ)作用于3-脱氢莽草酸(DHS)一步催化形成。利用该基因在大肠杆菌，芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌及酿酒酵母中实现了从葡萄糖合成原儿茶酸，该法环保、可持续，并且与化学法相比，具有经济竞争力，有很好的产业应用前景。除了从糖合成原儿茶酸，利用木质素合成原儿茶酸可以减少葡萄糖的使用，促进生物质的利用，减少农业废弃物对环境的污染。当前研究研究利用木质素合成原儿茶酸主要是针对木质素降解微生物，如红球菌，恶臭假单胞菌的转化木质素合成原儿茶酸及其衍生分子等。然而，木质素降解降解菌能够降解原儿茶酸，导致其原儿茶酸无法积累，需要进行基因的敲除等措施。利用生物安全菌株酵母酿酒酵母转化木质素合成原儿茶酸尚未进行研究，本研究针对木质素水解液主要单体组成，通过构建优化木质素单体合成原儿茶酸路线，实现了酿酒酵母高效合成原儿茶酸。

生物合成原儿茶酸以葡萄糖研究较多，大肠杆菌引入ubic和pobA基因合成了利用葡萄糖合成了大约110mg/L的原儿茶酸。另外，在谷氨酸棒杆菌中，引入ubic基因，通过在发酵罐中分批补料发酵获得了1140.0±11.6mg/L)原儿茶酸。Michael以蔗糖为原料在酿酒酵母中引入AroZ(DHS dehydratase)和设计degron-tagged Aro1实现了酿酒酵母CEN.PK利用蔗糖合成了原儿茶酸，通过发酵过程补充糖经过8天发酵最终获得了5.6g/L原儿茶酸。除了从糖出发，以芳香化合物未原料合成原儿茶酸，近期也有研究。戴玉杰等发明了利用苯酚为原料制备原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)的基因工程菌及其构建方法。该工程菌含有对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD和羟化酶基因pobA，以苯酚为原料，通过生物转化法将苯酚进行加羧获得对羟基苯甲酸，然后将对羟基苯甲酸3位氧化获得原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)。袁吉锋等发明了在大肠杆菌中导入PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA，实现了大肠杆菌从酪氨酸出发合成原儿茶酸。目前仍未见以木质素为原料合成原儿茶酸的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在酿酒酵母菌株基础上进行基因改造，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，获得的酿酒酵母工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物合成原儿茶酸，明显提高了原儿茶酸的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌酿酒酵母菌株为底盘菌株，转入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一种。