[发明专利]一种iPSC来源肝细胞的仿生微球大规模培养的方法及应用

说明书

本发明涉及一种iPSC来源肝细胞的仿生微球大规模培养的方法，利用微流控技术制备GelMA细胞微载体，在其表面包裹Bcl‑2重组蛋白以增强特异性抗凋亡活性，在镜下观察其形态，将包裹Bcl‑2重组蛋白的GelMA细胞微载体与iPSC来源肝细胞相结合，根据不同直径细胞微载体的细胞粘附情况筛选最优尺寸，大规模培养后经光镜、透射电镜观察细胞三维结构，检测细胞微载体上iPSC来源肝细胞活性及功能表达。本发明为一种能够满足临床用细胞数量、细胞活性高、生物相容性好、高效的基于iPSC来源肝细胞的仿生微载体培养方法。

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种iPSC来源肝细胞的仿生微球大规模培养的方法及应用。

背景技术

终末期肝病导致的肝功能衰竭治疗手段有限，单纯肝细胞移植或者生物人工肝是比较有前景的治疗手段。肝功能衰竭病人的肝支持作用完全依赖于所用肝细胞的特异性生物学功能。目前认为，要达到理想支持效果至少需要10¹⁰以上数量级的细胞，而在保障细胞活性的条件下，肝细胞数量越多，其支持及治疗效果将越佳，因此，肝细胞体外大规模培养技术己成为生物人工肝技术发展的核心技术。

人肝细胞是理想的肝细胞源，但是存在着伦理风险；肝脏肿瘤细胞系代谢功能较低，且有致瘤可能；干细胞是理想的新兴细胞源，但是分化不稳定；因此选择合适的、功能强大、低风险的功能肝细胞系也是目前研究的热点与难点。

虽然肝细胞体外大规模培养技术已取得了许多重大的进展，如共培养、生物材料包裹等，微载体的出现为肝细胞的大规模培养提供了新的思路，但微载体存在着大小规模不等、电荷性质不稳定、细胞黏附差，并且肝细胞结合微载体在体外大规模培养过程中仍容易受到氧气营养物质供应不足、代谢产物蓄积等各种因素的损伤，从而导致肝细胞的活性及功能下降，最终因为细胞凋亡影响治疗效果；并且如何把细胞从其已经生长的微载体转到新的没有细胞生产的微载体进行细胞放大，也是需要解决的问题。

因此，建立功能肝细胞结合微载体的大规模培养是临床目前面临的难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，设计、研制出一种能够满足临床用细胞数量、细胞活性高、生物相容性好、高效的基于iPSC来源肝细胞的仿生微载体培养方法及应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种iPSC来源肝细胞的仿生微球大规模培养的方法，利用微流控技术制备GelMA细胞微载体，在其表面包裹Bcl-2重组蛋白以增强特异性抗凋亡活性，在镜下观察其形态，将包裹Bcl-2重组蛋白的GelMA细胞微载体与iPSC来源肝细胞相结合，根据不同直径细胞微载体的细胞粘附情况筛选最优尺寸，大规模培养后经光镜、透射电镜观察细胞三维结构，检测细胞微载体上iPSC来源肝细胞活性及功能表达。

进一步的，采用圆柱形微载体大规模培养瓶进行细胞结合微载体培养，置于摇床上，采用旋转跷跷板式培养，摇速11rpm，角度4度，使得细胞与微载体在底层充分接触。

进一步的，所述的圆柱形微载体大规模培养瓶顶部具有微载体注入口，微载体注入口连接微载体注入管，圆柱形微载体大规模培养瓶的内部分为上、下两部分培养层，上培养层的具有中心旋转柱，所述中心旋转柱下端连接转盘，所述转盘上具有开口，转盘置于具有对应开口的隔层上，将转盘开口与隔层开口对齐时开口打开，连通上培养层和下培养层，构成旋转打开装置。

进一步的，所述的微载体注入管与中心旋转柱为一体连接结构，上部通过圆柱形微载体大规模培养瓶上的微载体注入口伸出培养瓶瓶体，下部安装在上培养层底部的的转盘中心。

进一步的，在下培养层在培养瓶壁上设有进液口、出液口和取样口；所述进液口处设有0.22um的斜角滤过膜，用于滤过杂质。

所述的圆柱形微载体大规模培养瓶底部为硅橡胶薄膜气体交换膜，有利于细胞与外界的气体交换。