[发明专利]酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在敲除了ADH6、ADH7、BDH2基因的酿酒酵母的基础上，转入外源基因4CL、ECH、vdh、vanA、vanB、metf1、ligM中的至少一种；过表达内源基因MET6；和/或，敲除内源基因MHT1、SAM4中的至少一种，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，该路径通过以上基因的改造调控四氢叶酸代谢强化菌株脱甲基作用促进香草酸转化合成原儿茶酸，实现了利用木质素单体及木质素合成原儿茶酸。不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成原儿茶酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。

背景技术

木质素是第二种天然聚合物，在大多数陆地植物中含量为干重的15％至40％(Ragauskas et al.，2014)。全球制浆造纸工业木质素年产量约5000万吨。然而，98％的木质素用于能源生产的燃烧或填埋场的处置，对环境造成严重威胁(Garlapati等人，2020)。在自然界中，存在着一些能够降解木质素的微生物，这些微生物可以将木质素转化利用，生产各种产品。最近，通过降解和转化木质素，在工程木质素降解微生物中产生了诸如黏康酸(MA)和聚羟基烷酸酯(PHA)和油脂等化学品(KosaRagauskas，2013；Lin et al.，2016；Liuet al.，2019；Mycroft et al.，2015；Salvachúa et al.，2018)。然而，如果木质素的苯环结构得不到有效利用，会造成资源的浪费。通过木质素苯环结构的转化，不同木质素单体底物可以转化为重要的芳香产物，，如原儿茶酸或儿茶酚的生物合成。原儿茶酸，作为药物，在临床上可用于治疗慢性气管炎、烧伤、小儿肺炎、菌痢、急性盂肾炎、急性胰腺炎及某种溃疡病的治疗。另外，其具有一定的抗氧化抗菌作用，对金黄葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌等有抑制作用。原儿茶酸是一种关键的代谢中间体，可以进一步转化为许多化学物质，如己二酸，吡啶2,4-二羧酸等。此外，在最近的研究中，原儿茶酸可以用做合成聚合物的单体。因此原儿茶酸具有广阔的应用前景。由木质素合原儿茶酸进行了初步的研究，木质素单体阿魏酸通过表达棒状杆菌NBRC100395的香草酸O-脱甲基酶基因(vanAB)在谷氨酸梭菌中产生原儿茶酸(Okai等人，2017)。然而，原儿茶酸通常通过多种木质素降解途径被木质素降解微生物同化为碳源(Clarkson et al.，2017)。因此，对木质素降解菌进行代谢工程研究，减少原儿茶酸的降解是十分必要的。敲除Rhodococcus jostii RHA1中的pcaHG可在6天培养中从木质素中产生原儿茶酸(Ramachandran et al.，2020)。除木质素降解微生物外，模式生物大肠杆菌表达香兰素脱氢酶(ligV)、香兰素O-脱甲基酶(ligM)和原儿茶酸脱羧酶(aroY)，它们从木质素解聚产物的香兰素中产生原儿茶酸和儿茶酚(Wu et al.，2017；Wu et al.，2018)。然而，工程大肠杆菌菌株在转化过程中大量积累了中间香草醛酸。这表明香草酸O-脱甲基酶是脱甲基过程中的一个瓶颈，需要对其进行优化以尽量减少香草酸的积累提高木质素转化效率。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在酿酒酵母菌株的基础上进行基因改造，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，获得的酿酒酵母工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物制备原儿茶酸，明显提高了原儿茶酸的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的酿酒酵母工程菌，以酿酒酵母菌株为底盘菌株，并进行如下改造：

a)转入外源基因4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)、ECH(烯酰CoA水合酶)vdh(香草醛脱氢酶)、vanA、(香草酸脱甲氧基酶亚基A)vanB(香草酸脱甲氧基酶亚基B)、metf1(5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶)、ligM(香草酸脱甲氧基酶)中的至少一种；

b)过表达内源基因MET6；