[发明专利]一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用

说明书

本发明公开了一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用。本发明提供了一株酿酒酵母，所述酿酒酵母保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021258，保藏日期为2021年3月19日；本发明定向进化筛选得到酿酒酵母CTPth‑2，耐受最低pH为2.32左右，这也是目前报道的酿酒酵母耐受的最低pH；为验证耐酸底盘细胞酿酒酵母CTPth‑2生产有机酸的潜力，本发明中以苹果酸为例，强化苹果酸合成的胞质途径，并外源表达来源于粟酒酵母的苹果酸转运蛋白，构建工程菌株CTPM3，在不添加中和剂的条件下，采用摇瓶发酵，苹果酸的发酵产量达到16.5g/L。

技术领域

本发明涉及一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

有机酸(Organic acid)，特别是短链有机酸(short-chain organic acid)，近年来广泛用于食品，生物医药，化妆品，洗涤剂，聚合物和纺织品等行业。短链有机酸是低分子量有机化合物，具有一个或多个酸性基团的化合物，其中最典型的是羧酸基团。根据碳原子数，短链有机酸可分为碳二(C2)，碳三(C3)，碳四(C4)，碳五(C5)和碳六(C6)有机酸。通常，C3有机酸包括丙酸，丙酮酸，乳酸和3-羟基丙酸。C4有机酸包括苹果酸，富马酸，琥珀酸酸和丁酸。C5有机酸包括衣康酸，α-酮戊二酸，戊二酸和木糖醛酸，而C6有机酸包括柠檬酸酸，粘康酸(主要是顺式，顺式粘康酸)，葡萄糖酸和己二酸。

而苹果酸和乳酸都是比较重要且常见的短链有机酸，其制备方法主要是生物发酵的方法，但是在制备苹果酸和乳酸的过程中，随着有机酸浓度的不断积累，而在反应体系中形成了低pH的环境，严重抑制了微生物的生长，造成有机酸的产量不足。

针对上述问题，目前工业上的解决方法是在发酵初始添加碳酸钙或者在发酵过程中添加中和剂；在发酵初始添加碳酸钙时，确实会解决由于反应体系当中的低pH的环境抑制微生物生长，而造成有机酸的产量不足的问题，但是，由于碳酸钙为固体粉末，后期需要进一步的分离去除并且需要对产物进行进一步的纯化，导致工序复杂，并且成本很高。

在工业生产中，另一种解决发酵过程中的低pH环境的方法为采用添加中和剂的方式来调节，但是添加的中和剂多是可溶性碱性溶液，容易在发酵培养基中生成盐类物质，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。

例如，公开号为CN105400711B的中国发明专利当中记载，采用其构建的基因工程菌株能够在温度为30℃，转速800rpm，通气量1.5vvm的条件下得到的苹果酸的产量为27.3g/L，但是在制备过程中需要采用8mM的KOH调节pH至5.0；

公开号为CN106190936B的中国发明专利当中记载，采用其构建的基因工程菌株能够在温度为30℃，通气量为0.5vvm，搅拌转速为200rpm，发酵过程中，使用25％(w/v)氢氧化钠水溶液作为中和剂调节发酵液pH为7.0。并且其发酵培养基也含有大量的K₂SO₄、KH₂PO₄、MgSO₄和CaCl₂，导致最终生成的产物主要以有机酸盐的形式存在，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。

由于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有耐酸性，是一种被广泛用作重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别，因此可以作为底盘细胞对其进行改造以得到一种高效生产有机酸的基因工程菌。

同时，现有技术当中，采用碱中和的方法，一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，或者后续酸解所用的酸反应不完全，还会造成资源的浪费和环境的污染。因此，目前急需开发一种耐酸底盘细胞工厂，在不添加或者减少中和剂添加的前提下，应用于有机酸的生产。

发明内容