[发明专利]稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系及其制备方法

说明书

本发明公开了一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系及其制备方法。利用Lipofectamine 2000转染试剂将不同的人源ApoE质粒(ApoE2‑EGFP，ApoE3‑EGFP，ApoE4‑EGFP)和对照组质粒(N‑EGFP)转染到中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary，CHO)中，随后用分选流式细胞仪将转染阳性的不同ApoE阳性细胞筛选出来，并用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和Western Blot进行ApoE的表达鉴定。本发明利用转染和细胞分选方法制备了能够稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞株，该细胞株为研究不同ApoE的生物学功能提供了一个很好的工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞 系及其制备方法。

背景技术

载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)，由299个氨基酸组成，分子量为34道尔顿，基因位于19号染色体上，ApoE主要通过与低密度脂蛋白受体(Low Density LipoproteinReceptor，LDLR)结合，在血浆胆固醇和甘油三脂的代谢中发挥作用。ApoE基因具有 多态性，其基因包含3种常见的等位基因：和产生六种表型E2/2、E3/3、 E4/4、E2/3、E2/4、E3/4。ApoE蛋白具有三个亚型：ApoE2，ApoE3和ApoE4，其区 别在于112位半胱氨酸(Cys)和158位的精氨酸(Arg)。ApoE3为一种较普遍的亚型，其 112位为Cys，158位为Arg。ApoE2在112位和158位都是Cys，则ApoE4在112位 和158位均为Arg。虽然每二种亚型之间只有易感氨基酸的微小变化，但这一微小变化 却引发了功能上的巨大改变。

ApoE基因多态性的分布具有种族和地域差异。对不同种族和地域的人群进行ApoE基因多态性分布的研究，已经成为近年来ApoE基因研究的热点之一。研究发现，ApoE 基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森病、冠心病、高血脂症、 脑梗塞等多种疾病的发生密切相关。研究表明，ApoE基因型在AD发病过程中具有基 因-剂量效应。用敲除ApoE基因的转基因小鼠研究也表明，ApoE决定着AD发作的 年龄风险，ApoE4明显地提前疾病发作年龄。大量人群调查发现，等位基因对应较 高的血浆胆固醇和LDL浓度，是心血管疾病的风险因子。

然而，迄今为止尚没有一个很好的体外细胞模型，可以为研究不同ApoE的生物学功能提供一个很好的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系及其制备方法，利用转染和细胞分选方法制备能够稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞 株，该细胞株为研究不同ApoE的生物学功能提供一个很好的工具。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系的制备方法，包括以下步骤：

(1)将CHO细胞在DMEM细胞培养基中进行体外培养；

(2)利用转染试剂将不同的人源ApoE质粒ApoE2-EGFP、ApoE3-EGFP、 ApoE4-EGFP和对照组质粒N1-EGFP转染到CHO细胞中；

(3)4-6小时更换新的培养基，24-48小时后加入阳性筛选试剂G418；

(4)筛选转染阳性的ApoE2-EGFP、ApoE3-EGFP、ApoE4-EGFP和对照N1-EGFP 细胞株；

(5)对筛选出的阳性细胞进行鉴定，获得稳定表达人源ApoE2-EGFP，ApoE3-EGFP和ApoE4-EGFP的CHO细胞株。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(1)中，所述细胞培养基是含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM细胞培养基。