[发明专利]一种重组自交系群体高密度遗传图谱的构建方法

权利要求书

1.一种重组自交系群体高密度遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

SLAF文库构建和高通量测序：包括三个方面；第一，使用训练数据选择SLAF的预先设计方案；酶切设计必须根据标记效率特征来决定，包括整个基因组的随机分布、基因组的唯一性以及选定标记之间的一致扩增效率；在预先设计方案的基础上,进行大规模的生产性试验；第二，SLAF-seq文库构建；基因组DNA是由为个体设计的一组酶消化的；在两轮PCR反应中加入双条码，对每个个体进行区分，便于样本池的大小选择，保持个体间片段大小一致；第三，高通量测序和基因型鉴定；采用Illumina配对端测序协议对合并的RRLs进行深度测序，并通过软件进行基因型定义和验证；

序列数据分组和基因分型：将低质量的读码过滤掉，然后根据双条形码序列将原始读码分成每个子序列；从每个高质量的reads中剪切条形码和末端5-bp位置后，用SOAP软件将相同样本的clean reads定位到玉米基因组序列；将定位到相同位置的序列定义为一个SLAF locus；然后在亲本间检测每个SLAF位点的单核苷酸多态性(SNP)位点，首先过滤掉3个以上snp的SLAFs；然后根据亲代序列深度21.22倍的reads来定义每个SLAF位点的等位基因，对每个子代序列深度8.05倍的reads来定义等位基因；对于二倍体物种，一个SLAF基因座最多可以包含4个基因型，因此将等位基因超过4个的SLAF基因座定义为重复SLAFs，然后丢弃；只有具有2到4个等位基因的SLAFs被鉴定为多态性，并被认为是潜在的标记物；所有多态性SLAFs位点均按亲代和子代SNP位点的一致性进行基因分型；根据一种分离型(aa×bb)的RIL群体类型，分析了多态SLAFs的标记码；然后使用贝叶斯方法进行基因型评分，以进一步确保基因型的质量；

遗传连锁图谱构建：根据标记位点在B73_RefGen_V4基因组上的位置，将标记位点主要划分为连锁群(LGs)；其次，计算标记间的修正优势对数(MLOD)分数，进一步验证标记对每个LGs的稳健性；MLOD评分0.05的标记在订购前进行过滤；为了保证高密度、高质量的遗传图谱的构建，采用新开发的HighMap策略对SLAF标记进行排序，纠正LGs内的基因分型错误；首先，利用两点分析法计算重组频率和LOD评分，用于推断连锁相；然后，结合增强吉布斯采样、空间采样和模拟退火算法，进行标记排序的迭代过程；在排序过程的第一阶段，使用空间抽样选择SLAF标记；按照测试交叉的优先顺序随机抽取一个标记，将重组频率小于给定采样半径的标记从标记集中排除；然后利用模拟退火算法寻找最佳映射顺序；退火系统继续进行，直到在一系列连续的步骤中，新生成的映射顺序被拒绝；采用阻塞吉布斯采样法，在得到最优的样本标记图谱顺序后，估计双亲的多点复合频率；利用更新后的重组频率对两个亲本映射进行积分，优化了下一个模拟退火周期的映射顺序；在3-4个循环之后，一旦获得稳定的图谱顺序，我们就转向下一轮图谱构建循环；选择当前未映射标记的子集，并将其添加到先前的样本中，以减小样本半径；映射算法不断重复，直到所有标记都被正确映射。

2.根据权利要求1所述的一种重组自交系群体高密度遗传图谱的构建方法，其特征在于，采用Illumina配对端测序协议对合并的RRLs进行深度测序的具体方法是，利用玉米B73_RefGen_V4参考基因组模拟不同酶产生的标记物的数量，设计了标记物发现实验；然后进行SLAF中间实验，按照预先设计好的方案进行SLAF文库构建；在264个RIL群体中，使用两种酶，其中两种酶分别为HaeIII和Hpy166II；在37℃条件下消化基因组DNA；随后用Klenow片段(3’→5’)(NEB)和dATP，将单个核苷酸(A)悬挑添加到已消化片段中；然后使用T4 DNA连接酶将双标记标记的测序适配器进行PAGE纯化；连接到a尾片段；采用稀释的限制性连接DNA样品、dNTP、高保真DNA聚合酶和PCR引物进行聚合酶链式反应(PCR)；PCR产物随后使用AgencourtAMPure XP beads纯化并汇集；混合样品用2％琼脂糖凝胶电泳分离；使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)对大小在414到464个碱基对带有索引和适配器的片段进行切除和纯化；凝胶纯化后的产品被稀释；在Illumina平台系统上进行配对测序。