[发明专利]检测AML中PRAME基因相对表达量的试剂及方法

说明书

本发明公开了用于检测PRAME基因相对表达量的引物、探针及方法和试剂盒，所述引物和探针包括：(1)检测PRAME基因表达量的引物PRAME‑F、PRAME‑R，探针PRAME‑Probe；(2)检测内参基因abl的引物abl‑F，abl‑R，探针abl‑Probe。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。本发明能快速检测样本中是否存在PRAME基因及其表达量的多少，可为人类急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)提供精准的决策信息和预后信息，以辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断，具有重要的临床应用价值。

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中PRAME基因的方法、引物、探针和试剂盒，采用荧光探针实时定量PCR技术。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是急性白血病中最常见的类型，是以造血干细胞快速增殖为特征的造血干细胞恶性疾病，患者表现为未成熟细胞异常积累以及正常造血细胞受到抑制。AML预后多变，从几周生存期到完全缓解期及治愈期。在成人AML患者中，5年无病生存率与年龄密切相关，AML患者的平均5年生存率为21.4％，而年龄在75岁以上的患者的5年生存率仅为1％。由于AML发展的分子机制不同，AML患者的预后仍然难以准确估计。AML预后受多种因素影响，包括一般预后因素(发病年龄、体重、初诊外周血WBC数、继发性AML、治疗反应)和遗传学预后因素(重现性染色体异常、基因突变)，其中PRAME基因是一个研究热点。

PRAME基因最早是从黑色素瘤中分离出来的一类肿瘤相关抗原，定位于染色体22q11，在多数正常的组织和细胞中均不表达，而在正常的睾丸组织以及肺癌、肾癌、肉瘤中呈高表达状态，属于肿瘤-睾丸抗原。PRAME基因编码的产物是一类膜蛋白，能够抑制RARa途径；在维甲酸存在的条件下，PRAME能够与RARa结合并阻断了该受体的激活过程，进而通过趋化Polycomb蛋白来阻断RARE启动下游转录的功能，最终阻断了细胞凋亡的效应。

有研究指出白血病患者PRAME、WT1基因的同时表达能够很好的检测白血病患者的微小残留病，进而使白血病患者的生存率得到明显提高。提示可以通过检测PRAME基因的表达情况评估AML的预后，并且可以为患者制定个体化的治疗方案。因此AML患者PRAME基因表达量可作为临床评估疾病的发生、发展及判断预后的有效指标。

实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)是在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料，使之荧光信号随着扩增产物的增加而成比例增长，仪器实时检测每一个循环结束后的荧光强度，通过与标准曲线对比得出定量结果。可以直接检测目的基因的起始数量，从而动态监测目的基因水平。从扩增到产物分析都是闭管操作，最大限度避免了污染，无PCR后处理。设计的特异性TaqMan探针使整个体系灵敏度和特异性都大大提高，

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和目的基因PRAME的定量标准曲线，检测目的基因PRAME相对于内参基因ABL的表达水平。通过调整引物和探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，可使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足PRAME基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。

本发明提供了一种用于PRAME基因相对表达量的试剂，所述试剂包括(1)检测PRAME基因的上游引物PRAME-F、下游引物PRAME-R和探针PRAME-Probe，其中，

PRAME-F：AGTGCTGATGAAGGGACAACA；

PRAME-R：GTCCTGATGAGAGTTCTTCCGTA；

PRAME-Probe：FAM-CTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGA-TAMRA。