[发明专利]一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用

说明书

本发明提出了一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用，属于生物工程技术领域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明DNA聚合酶来源于嗜热微生物Pyrococcus yayanosii，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用。

背景技术

DNA聚合酶利用dNTP作为底物，以DNA单链作为模板，催化DNA聚合物合成。除了聚合酶活性DNA聚合酶还具有3’-5’外切酶活性和5’-3’外切酶活性，前者在DNA复制中对新合成链进行校对，消除错误掺入的核苷酸，后者参与DNA合成中RNA引物链的去除，完成基因组DNA子链DNA合成，同时5’-3’外切酶活性还参与DNA修复。

不同的DNA聚合酶的结构和功能上有所差异。各种DNA聚合酶在生命科学中应用广泛，其中耐热DNA聚合酶多应用于PCR(聚合酶链式反应)技术，尤其是高忠实性的DNA聚合酶在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。其它DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶和phi29DNA聚合酶在等温核酸扩增和二代测序中应用广泛。

Pyrococcus yayanosii分离自海底热液口，是一株严格厌氧嗜压超嗜热古菌。该古菌的温度生长范围是80～114℃，最佳生长温度为99℃，是研究开发具有热稳定的极端耐热酶的重要菌株资源。

目前商业化的DNA聚合酶仍然存在忠实性低，延伸效率差，污染物或抑制剂耐受能力差等问题。因此，有必要开发一种高忠实性的DNA聚合酶体系，用于PCR扩增目的DNA。

CN 108795900 B公开了一种DNA聚合酶及其制备方法，为如下A1)-A3)中的任一种：A1)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°N DNA聚合酶相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低，该DNA聚合酶制备方法复杂且不具有高忠实性。

CN 112029744 A公开了一种DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用，源于嗜热微生物Thermococcus eurythermalis，具有热稳定性高、扩增能力强，DNA扩增产量高，扩增忠实性高等特征，可应用于PCR扩增目的DNA。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。但该DNA聚合酶纯化较难，制备工艺复杂。

发明内容

本发明的目的在于提出一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种高忠实性DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步保护一种编码上述高忠实性DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列表如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步保护含上述高忠实性DNA聚合酶的重组表达菌。

作为本发明的进一步改进，所述重组表达菌为大肠杆菌。

本发明进一步保护一种上述高忠实性DNA聚合酶的基因的制备方法，包括以下步骤：

(2)对权利要求3所述重组表达菌进行扩大培养、诱导表达；