[发明专利]一种在肌源性细胞特异性高表达SIA的重组表达载体及其应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种在肌源性细胞特异性高表达SIA的重组表达载体及其应用。所述重组表达载体启动子为Psubgt;EMS/subgt;，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码SIA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明使用柔性肽(GGGGS)3替代C肽对胰岛素原进行改造，获得了高活性单链胰岛素类似物SIA，采用增强型肌肉特异性启动子Psubgt;EMS/subgt;调控SIA的表达，实现了高活性单链胰岛素类似物SIA在骨骼肌细胞中特异性高效表达并分泌出胞外进入血液循环系统，既可以达到有效降血糖的效果，又同时避免异位表达产生不必要的副作用。本发明所述重组表达载体可用于制备治疗I型糖尿病的药物。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种在肌源性细胞特异性高表达SIA的重组表达载体及其应用。

背景技术

糖尿病是由于机体对葡萄糖代谢产生紊乱而导致体内血糖水平较高的一类疾病，受遗传因素和环境因素影响较大。随着社会、经济的发展和进步，人们的生活方式和饮食习惯发生了较大变化，导致全球糖尿病患者的人数在逐渐增加。糖尿病通常分为1型和2型糖尿病。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，通常在青少年时期发病，其发病机理主要是胰岛β细胞成分被免疫系统错误识别为抗原而受到了破坏，使得体内胰岛素绝对缺乏，进而导致葡萄糖代谢失调和血糖升高。

胰岛素是目前治疗1型糖尿病唯一有效药物，但长期的皮下注射容易造成疼痛、皮肤感染和皮下淤血等，并且由于促进脂肪合成，容易造成患者体重增加；另一方面，1型糖尿病患者的血糖谱呈波动大的特点，原因在于患者独立注射胰岛素时难以准确、灵活地调整剂量，容易引起波动性高血糖和低血糖事件。为了解决这一问题，目前有许多新的思路：1.胰岛β细胞置换：人全胰腺或胰岛移植、基因工程胰岛素分泌细胞、生物人工胰腺；2.自动胰岛素输送装置；3.体细胞基因治疗；4.将胰岛α细胞转换为胰岛β细胞，等等。

1型糖尿病人需要长期、反复、高频率(多数为每日一次)肌注胰岛素，其疗效确切但也给病人带来不便和不适。基因治疗相对于胰岛移植、胰岛细胞重编程等操作，具有操作简单、花费较少、普适性高等多种优势。因此，1型糖尿病的有效基因治疗一直是备受关注的重要研究方向。

基因治疗是将目的基因片段经过体外克隆、构建表达载体后，再用特殊的传递方法将携带外源基因的表达载体传递到细胞内，并在细胞内完成目的蛋白的表达，在胞内或胞外特定位点发挥应有的生理作用，从而实现外源目的基因代替变异/缺失基因以实现功能恢复，以此达到疾病缓解和治疗的目标。

基因治疗的体系主要有三个关键环节，分别包括(1)功能基因：根据疾病的发病机制选择正确的目的基因作为治疗基因。1型糖尿病的治疗基因主要是胰岛素基因。(2)基因传递：由于基因治疗需要将外源表达载体传递到生物体内，因此选择最优的基因传递系统是将外源基因高效导入生物体内目标位置的关键。(3)基因表达：在外源基因传递到靶组织、器官或靶细胞后，需要确保外源基因能在该部位特异性高效表达，即表达产物要达到足够的量以产生有效生物学功能，同时还要避免异位表达产生不必要的副作用。

在生理条件下，胰岛素基因转录、翻译出的胰岛素原(proinsulin)为含有B链、C肽和A链的一条单链前体肽，需要在胰岛β细胞中经过特定的酶切掉C肽，A、B链间通过两条二硫键形成成熟胰岛素，方能发挥生理作用。C肽结构冗长且刚性较大，影响胰岛素活性的发挥，未切掉C肽的胰岛素原的活性只有成熟胰岛素的5％。将胰岛素原中的C肽切除的体系为胰岛β细胞所独有，这意味着当外源胰岛素基因试图在非胰岛β细胞(如肝脏和肌肉组织)中进行表达时，将很难得到高活性的成熟胰岛素。

因此，目前有必要探究一种更为有效的用于治疗糖尿病的分子工具。

发明内容

本发明目的在于提供一种在肌源性细胞特异性高表达SIA的重组表达载体及其应用，所述重组表达体在骨骼肌部位特异性高效表达，一方面表达足量的SIA可产生有效降低血糖的效果；另一方面可避免异位表达产生不必要的副作用。