[发明专利]一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备

权利要求书

1.一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：由小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白、H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白以及H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；

步骤二：编码H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸；编码H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸；编码小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白和H9N2亚型禽流感病毒的NA蛋白的核苷酸；

步骤三：利用核糖体内部进入位点将小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白基因与H9N2亚型禽流感病毒的NA基因串联后进行基因合成，并将这段串联基因命名为MgagN2；

步骤四：构建表达禽流感病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为：

根据H3N2亚型禽流感病毒的HA基因设计引物；以同样的方法设计H9N2亚型禽流感病毒的HA基因的引物，利用HA基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR扩增，将扩增后的HA基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得HA基因重组杆状病毒穿梭质粒；同样，将人工合成的MgagN2基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得MgagN2基因重组杆状病毒穿梭质粒；将穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选获得重组杆粒；利用脂质体介导转染法，将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞，获得三种重组杆状病毒，分别命名为：rBV-H3、rBV-H9、rBV-MgagN2；

步骤五：禽流感VLPs的制备和纯化，具体为：

将三种重组杆状病毒rBV-H3、rBV-H9、rBV-MgagN2共接种感染Sf9昆虫细胞，四种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的VLPs会分泌到细胞培养上清中，经低速离心去除细胞碎片后，采用不连续的40％-60％蔗糖密度梯度离心方法得到纯化的VLPs。

2.根据权利要求1所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：步骤五中，三种重组杆状病毒共接种感染Sf9昆虫细胞时，含有重组杆病毒的溶液体积比为：rBV-H3:rBV-H9:rBV-MgagN2＝1:1:3。

3.根据权利要求1所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：HA蛋白分别来自H3N2和H9N2亚型禽流感病毒；基质蛋白为小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.1：

SEQIDNO.1

atgaggaccgttattgcattgagctacattctctgcttggcttttggacagaaccttccagggaatgacaacagtacagcaacactatgcctgggacatcatgcagtgccgaatggaacaatagtgaaaacaatcaccgacgatcagattgaggtgaccaatgctactgagctggtccaaagttcctcaacagggaaaatatgcaacaatccccacaagatccttgatggaagagattgcacattaatagatgccatgcttggagatcctcattgtgatgtttttcaagatgagacatgggatctcttcgttgagcgaagcaatgctttcagcaattgttatccttatgatgtaccggattatgcctcccttcgatccttagttgcttcatcaggcacactagaattcattactgaaggtttcacctggacaggagtgagccagaatggaggaagcggtgcctgcaaaaggggacctgccaacggtttcttcggtagattgaactggttgactaagtcagggaactcatacccactgttaaacgtgactatgccaaacaatgataattttgacaagctatacatctggggtgttcaccacccgagtacaaaccaagaacagactaacctgtatgttcaggcctcaggaagagtcacagtctctaccaggagaagtcaacagaccatagtcccgaacattggatctagaccttgggtaaggggtcaatctggaagaataagcatctactggacaatagtcaaacctggagatgtaccggtaatcaatagtaacggaaacctgattgcgcctcggggatacttcaagatccgaactgggaaaagctcaataatgagatcagatgcacctatagagacttgcatctcagaatgcatcactccaaatggaagcatccctaatgacaagccttttcaaaatgtaaacaaaatcacatacggggcatgtcccaaatatgtaaagcaaaataccctaaaattggctacaggaatgaggaatgtgcctgagaagcaaaccagaggtctattcggtgcaatagcagggttcatagagaatggatgggaaggaatgatagatggctggtatggcttcagacaccaaaattctgaaggcacaggacaagcagcagatcttaaaagcacccaagcggccattgaccaaatcaatgggaaattgaacagagtgattgaaaagacgaatgaaaaattccatcagatcgaaaaagaattctccgaggttgaaggaaggattcaagatcttgagaaatatgtcgaagacacaaaggtggacctctggtcttataatgcagagcttcttgttgctctagagaatcagcatacaattgatttgaccgattctgagatgaacaagttatttgaaaaaaccagaaggcaactgagagagaatgctgaagacatgggcaatggttgcttcaaaatatatcacaaatgtgacaatgcctgcatagaatcaattaggaatggaacttatgaccatgacatatatcgagatgaggcactgaacaatcggttccagatcagaggtgtagaactaaaatctggatacaaagactggatcctgtggatttcctttgccatatcatgctttttgctttgtgttgtgttgttggggttcattatgtgggcttgccagcgaggcaacattaggtgcaacatttgcatttga；

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.2：

SEQIDNO.2

atgggagccgtatcattgataactatgctactagtagcaacagtaagcaatgcagacaaaatctgcatcggataccaatcaacaaactccacagaaactgtagacacactaacagaaaacaatgtccctgtgacacatgccaaagaattgctccacacagagcacaatgggatgctatgtgcaacaaacttgggacatcctcttattctagacacctgtaccattgcaggactaatctatggcaatccttcttgtgatctattgctgggaggaagagaatggtcttacatcgtcgagagaccatcggctgtcaatggattgtgctaccccgggaatgtagaaaatctagaagaactaaggtcacttttcagttctgctagttcttatcaaagaatccagatttttccggacacaatatggaatgtgtcttacagtggaacaagcaaagcatgttcagattcattctacagaagcatgagatggttgacccaaaagaacaacgcttaccctattcaagacgcccaatacacaaataatcgagaaaagaacattcttttcatgtggggtataaatcacccacccaccgagactacacagacagatctgtacacaagaaccgacacaacaacaagtgtggcaacagaagaaataaataggaccttcaaaccattgataggaccaaggcctcttgtcaatggtttgcagggaagaattgattattattggtcggtattgaaaccaggtcaaacactgcgagtaagatccaatgggaatctaatagctccatggtatggacacattctttcaggagagagccacggaagaatcctgaagactgatttgaaaaggggtagctgtacagtgcaatgtcagacagaaaaaggtggcttaaacacaacattgccattccaaaatgtaagtaagtatgcatttggaaactgctcgaaatatgttggagtaaagagtctcaaacttgcagttggtctgaggaatgtgccttctaaatctagtagaggactatttggggccatagctggattcatagagggaggttggtcaggactagttgctggttggtatggattccagcattcaaatgaccaaggggttggtatggcagcagatagagactcaacccaaaaggcaattgataaaataacatccaaagtgaataacatagtcgataaaatgaacaaacagtatgaaattattgatcatgaattcagcgaggttgaaaatagacttaacatgatcaataataagattgatgatcaaattcaagacatatgggcatataacgcagaactgctagtgctacttgaaaaccagaaaacactcgatgagcatgatgcaaatgtaaataatctatataataaagtgaagagggcattgggttccaatgcagtggaagatgggaaaggatgtttcgagctatatcacagatgtgattaccagtgcatggagacaattcggaacgggacctacaacaggaggaaatatcaagaggaatcaaaattagaaaggcagagaatagagggggtcaagctggagtctgaaggaacttacaaaattctcaccatttattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatgggtcttgcagatgcaacatttgtatataa；

小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白和H9N2亚型禽流感病毒的NA蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.3：

SEQIDNO.3

atgggccagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgccaaacctaaacctcaagttctttctgacagtggggggccgctcatcgacctacttacagaagaccccccgccttatagggacccaagaccacccccttccgacagggacggaaatggtggagaagcgacccctgcgggagaggcaccggacccctccccaatggcatctcgcctacgtgggagacgggagccccctgtggccgactccactacctcgcaggcattccccctccgcgcaggaggaaacggacagcttcaatactggccgttctcctcttctgacctttacaactggaaaaataataacccttctttttctgaagatccaggtaaactgacagctctgatcgagtctgttctcatcacccatcagcccacctgggacgactgtcagcagctgttggggactctgctgaccggagaagaaaaacaacgggtgctcttagaggctagaaaggcggtgcggggcgatgatgggcgccccactcaactgcccaatgaagtcgatgccgcttttcccctcgagcgcccagactgggattacaccacccaggcaggtaggaaccacctagtccactatcgccagttgctcctagcgggtctccaaaacgcgggcagaagccccaccaatttggccaaggtaaaaggaataacacaagggcccaatgagtctccctcggccttcctagagagacttaaggaagcctatcgcaggtacactccttatgaccctgaggacccagggcaagaaactaatgtgtctatgtctttcatttggcagtctgccccagacattgggagaaagttagagaggttagaagatttaaaaaacaagacgcttggagatttggttagagaggcagaaaagatctttaataaacgagaaaccccggaagaaagagaggaacgtatcaggagagaaacagaggaaaaagaagaacgccgtaggacagaggatgagcagaaagagaaagaaagagatcgtaggagacatagagagatgagcaagctattggccactgtcgttagtggacagaaacaggatagacagggaggagaacgaaggaggtcccaactcgatcgcgaccagtgtgcctactgcaaagaaaaggggcactgggctaaagattgtcccaagaaaccacgaggacctcggggaccaagaccccagacctccctcctgaccctagatgactag；

H3N2亚型禽流感病毒的HA基因上、下游引物序列为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5：

SEQIDNO.4

cggatccatgagtcttctgacc；

SEQIDNO.5

gctctagatcacttgaaccgctg；

H9N2亚型禽流感病毒的HA基因的引物，上、下游引物序列分别为SEQIDNO.6和SEQIDNO.7：

SEQIDNO.6

cggatccatgaagacaaccatt；

SEQIDNO.7

ccaagcttctatcagtttactcaaatg。