[发明专利]一种调控RSPO2基因转录活性的方法

说明书

本发明公开一种调控RSPO2基因转录活性的方法，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明以RSPO2基因启动子区DNA甲基化以及RSPO2为研究对象，通过分析RSPO2在卵泡发育过程中的表达与甲基化水平的关联，然后利用5‑Aza‑CdR或DNMT1‑siRNA验证RSPO2启动子低甲基化促进其表达，最后找到RSPO2启动子CGI2区的低甲基化招募转录因子E2F1的结合，进而促进RSPO2的转录表达。本发明通过探究DNA甲基化调控RSPO2转录表达机制的应用，对研究RSPO2基因启动子区DNA甲基化参与卵巢卵泡闭锁以及初情启动等的分子机制具有很好的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及一种调控RSPO2基因转录活性的方法。

背景技术

研究表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR导致哺乳动物体内DNA甲基化紊乱，阻碍卵泡成熟和延缓初情启动。DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)直接修饰位于CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶残基(cytosine残基，5-mC)来调控基因转录，DNMT1负责在DNA复制过程中维持DNA甲基化。在多囊卵巢综合征患者中，DNMT1通过介导CDKN1A启动子的低甲基化抑制颗粒细胞(granulosa cells，GCs)的增殖和卵泡的生长。综上所述，DNA甲基化可能通过调节GCs中关键基因的表达参与卵泡发育和初情期启动。

RSPO2(R-Spondin 2)是R-Spondin家族成员之一，能激活并增强Wnt信号通路。在哺乳动物体内，RSPO2促进小鼠卵巢细胞的增殖以及雌激素分泌，抑制凋亡，进而促进卵泡的生长发育。转录因子E2F1是E2F家族成员之一，通过调节牛GCs的增殖和雌激素分泌参与卵泡发育。大量研究表明，CG二核苷酸的高甲基化状态可能通过阻碍转录因子的结合来调控基因的表达。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种调控RSPO2基因转录活性的方法。我们通过网站预测发现RSPO2启动子存在两个CpG岛，且CpG岛上预测到的E2F1结合位点最多。由此我们提出假设DNA低甲基化可能通过招募E2F1结合到RSPO2启动子，进而促进RSPO2的转录表达。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种调控RSPO2基因转录活性的方法，包括如下步骤：

通过降低RSPO2基因启动子区DNA甲基化水平来促进猪卵巢颗粒细胞中RSPO2基因转录活性；或通过提高RSPO2基因启动子区DNA甲基化水平来降低猪卵巢颗粒细胞中RSPO2基因转录活性。

进一步的，通过降低RSPO2基因启动子区DNA甲基化水平能招募转录因子E2F1促进猪卵巢颗粒细胞中RSPO2基因转录活性；

进一步的，降低RSPO2基因启动子区DNA甲基化水平是通过DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR或抑制DNMT1基因表达的siRNA(DNMT1-siRNA)转染到猪卵巢颗粒细胞的方式实现。

所述的抑制DNMT1基因(Gene ID：606746)表达的siRNA的序列如下：

DNMT1-siRNA：5′-TACAGTTGTTGACAAACGAG-3′；

进一步的，提高RSPO2基因启动子区DNA甲基化水平是通过对RSPO2基因启动子区进行甲基化处理。

优选的，RSPO2基因启动子区DNA甲基化水平为RSPO2基因启动子区中CGI2(-1014/-362)的DNA甲基化水平；

进一步的，CGI2(-1014/-362)包括CGI2-1(-1014/-721)、CGI2-2(-709/-362)；

进一步的，转录因子E2F1结合在CGI2区域-758/-749bp以及-563/-553bp。