[发明专利]一种增强生防菌杀灭白蚁效果的双链核酸Dicer-1 dsRNA

说明书

本发明公开了一种增强生防菌杀灭白蚁效果的双链核酸Dicer‑1 dsRNA。本发明中Dicer‑1 dsRNA的设计来源于黑胸散白蚁Dicer‑1基因，DNA序列为SEQ 1。基于SEQ 1序列，设计并克隆含有目的基因Dicer‑1片段SEQ 2的纯净质粒。通过SEQ 2序列，设计并克隆Dicer‑1 dsRNA模板，通过T7体外转录系统合成Dicer‑1 dsRNA。将Dicer‑1 dsRNA与白蚁食物混合，随后放入白蚁群体中供白蚁取食。用生防真菌感染取食Dicer‑1 dsRNA的白蚁后，染菌白蚁相互理毛行为次数下降，疾病防御相关基因发生紊乱，抗菌活性下降，死亡率显著上升。这表明Dicer‑1 dsRNA能够显著提高生防真菌对白蚁的生物防治效果。本发明获得的Dicer‑1基因可作为白蚁防治的靶标分子，与生防真菌结合使用，有效提高白蚁防治效果，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及Dicer-1基因和Dicer-1 dsRNA，一种增强生防菌杀灭白蚁效果的双链核酸Dicer-1 dsRNA。

背景技术

白蚁是一种古老的社会性有害昆虫，能够危害农林作物、房屋建筑和水利工程等，具有“无牙老虎”之称，严重威胁人民的生命和财产安全。在我国，白蚁危害主要发生在华中地区、华南地区、西南地区以及东南沿海地区。我国每年因白蚁危害造成的经济损失达100亿人民币。目前，化学防治仍是白蚁防治的主要手段。然而，基于对环境、人畜安全的考虑，许多高毒高污染化学药剂已被禁用。因此，研究和开发无毒、无污染、对环境友好的生物防治药剂成为白蚁防治领域的迫切需求之一。生防真菌，例如绿僵菌（Metarhizium）和白僵菌（Beauveria）是应用最为广泛的昆虫致病真菌之一，其生防药剂对蝗虫、马尾松毛虫、蛴螬、天牛、象甲等害虫致病力强，具有一定专一性、对人畜无害、不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性等优点，因此备受推崇。前期研究结果表明，绿僵菌对单头白蚁具有较强致死效果，但是随着白蚁密度的增加，绿僵菌的致死效果降低。之所以出现这种现象，研究者认为与白蚁独特的行为防御和生理免疫有关。

白蚁抵御病原菌侵染的过程中，相互理毛行为是一种重要的行为防御机制：当白蚁遭受绿僵菌侵染时，白蚁聚集成群，彼此通过口器舔舐同伴皮肤表面并及时移除体表绿僵菌孢子。研究发现，染菌白蚁通过加强相互理毛，能够在染菌后3小时内清理体表80%的绿僵菌孢子。此外，白蚁抵御绿僵菌侵染的过程中，上调免疫基因表达是一种重要的生理免疫机制：模式识别受体识别病原菌后，激活包括体液免疫和细胞免疫在内的先天免疫系统，最后通过抗菌肽和免疫细胞杀灭病原菌。此外，一些氧化还原基因（例如解毒基因和抗氧化基因）也在白蚁抵御绿僵菌侵染过程中发挥重要作用。因此，如何削弱白蚁行为防御和生理免疫成为提高白蚁生物防治效果的关键。

Dicer-1是动物体内加工生成miRNAs（一种18-25 bp的非编码RNA）的关键酶之一。miRNAs能够负向调控多个功能相同或者不同的靶标基因，在动物生长、发育、代谢、免疫、行为等方面发挥重要作用。相比于其他靶标基因，Dicer-1基因介导的miRNAs功能紊乱对动物的影响范围更大、程度更深。因此，本发明以白蚁Dicer-1基因为靶标基因，通过喂食白蚁Dicer-1 dsRNA沉默Dicer-1基因，削弱白蚁群体卫生行为和个体生理免疫，从而提高金龟子绿僵菌对白蚁的杀灭效果，推动RNAi介导的白蚁生物防治技术的发展。

发明内容