[发明专利]基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法

说明书

本发明涉及一种生物检测领域，尤其涉及基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法及该方法使用的引物对和试剂盒。本发明基于COI序列和D‑loop序列分别设计两组特异性LAMP引物组(引物LAMPCOI及LAMPCR)。实验结果显示：引物LAMPCOI可对6种东方鲀属河鲀物种进行扩增，与非东方鲀属的2种河鲀、7种非河鲀样品均不发生反应；引物LAMPCR只与暗纹东方鲀物种发生特异性反应，与其他河鲀及非河鲀样品不发生反应。两组引物的灵敏度均为0.1%，而检测限达到10 pg。将两组引物用于市售商品的物种鉴定：在30种河鲀制品中，均检测到东方鲀属物种成分，12‑14号、21‑30号样品则被鉴定为暗纹东方鲀；而在20种无标签鱼肉制品中，只有17‑20号样品检测到含有东方鲀属物种成分。

技术领域

本发明涉及一种生物检测领域，尤其涉及基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法寄 该方法使用的引物对和试剂盒。

背景技术

河鲀鱼(Pufferfish)作为我国等亚洲沿海地区的传统美食，具有非常高的营养价值和经 济价值。但野生河鲀含有剧毒，食用不当可造成严重的中毒甚至死亡。市场上存在河鲀鱼冒 充其他水产品出售的现象，严重损害消费者的生命健康。仅凭形态学方法很难对河鲀制品进 行鉴别，因此急需建立河鲀物种及其制品的快速、准确的分子鉴定方法。

食品鉴定主要有传统形态学方法、理化分析以及分子生物学方法。经过深加工的食品， 完全不具备活体状态下的形态后，形态学鉴定的方法完全不能使用。食品的理化分析是指借 助测量工具或仪器，针对蛋白质和脂肪等性质进行分析，常见方法有酶联免疫吸附分析 (ELISA)、免疫荧光技术(IFT)和高效液相色等方法。但是这些方法往往需要较为新鲜的样品， 一旦食品变质，就会对鉴定结果产生影响。此外，近些年新兴的无损检测技术也受到越来越 多的关注。该技术可以利用光学、电磁学和声学的技术，对食品的表面或内部的结构和性质 进行检测。例如：X射线法、太赫兹技术和红外光谱法。这些方法虽然快速、无损、信息量 大，但是其仪器的维护成本和模型的建立与改进需要的后期成本和技术门槛太高。

为此，申请人申请的中国发明专利申请(CN108950007A，公开号：20181207)以4种我 国东部沿海地区常见的河鲀为研究对象，即河鲀有黄鳍东方鲀(Takifuguxanthopterus)、 暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀(Takifuguflavidus)和红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes)，筛选构建适合的DNA条形码COI序列，并在此基础上，设计2对HRM 引物，提供一种基于COI序列的河鲀及其他鱼肉制品的HRM快速鉴定方法。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等 于2000年提出，是一种新型的核酸等温扩增技术，即在恒温条件下利用一种具有链置换功能 的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)进行核酸的快速扩增。其引物设计主要针对目的片段 5’端和3’端的6个区域设计2对特异性引物，包括1对内引物(FIP、BIP)、1对外引物 (F3、B3)。在60～65℃的恒定温度下，内引物识别相应的位点并延伸，同时外引物在Bst DNA polymerase的作用下将内引物形成的链置换出来，形成一个哑铃状结构的DNA片段，为后续 反应提供模板。之后内引物对其进行识别、延伸，最终形成一系列茎环结构和多环花椰菜结 构的DNA片段混合物。