[发明专利]一种间充质干细胞提取物及其提取方法和应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：从脐血中分离脐带间充质干细胞；

S2：对分离后的脐带间充质干细胞进行传代培养，取传代培养的P5～P25代人脐带间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80％融合时，弃掉培养液；

S3：先用磷酸盐缓冲液对培养后的细胞进行洗涤，然后加入无血清培养液继续培养70～75h，随后分离无血清培养液与细胞；

S4：将细胞用消化液消化后，再超声破碎，然后离心并收集上清液；

S5：将S3所得的无血清培养液与S4中的上清液混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于，脐带间充质干细胞的分离包括以下步骤：

SS1：取脐血，按1:3～5的体积比与PBS缓冲液混合，然后滴入与脐血等体积的淋巴细胞分离液，于600～750g下离心10～20min；

SS2：抽取白膜层细胞，先用PBS缓冲液洗涤，再用基础培养液重悬；

SS3：将非特异性促贴壁蛋白及特异性促贴壁蛋白涂抹于培养皿底部，然后将重悬后的白膜层细胞接种到培养皿中，并于37℃以及低氧条件下培养；

SS4：待原代细胞融合率达到60％时进行传代培养；

SS5：继续在37℃以及低氧条件下对传代的脐血间充质干细胞进行培养，待细胞融合率达到80％后进行传代；

SS6：收集脐血间充质干细胞，即得。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于，所述基础培养基包括以下体积浓度的组分：

MCDB 131 50～80mL/L，人血清蛋白60～90μl/L，乳铁传递蛋白200～300μl/L，地塞米松10～15μl/L，纳他霉素20～30U/L和青霉素90～120U/L。

4.根据权利要求2所述的间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述非特异性促贴壁蛋白为纤连蛋白；所述特异性促贴壁蛋白为CD90单克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述低氧条件为氧气15％，二氧化碳5％和氮气80％。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于，所述细胞生长液包括以下体积百分比的组分：

复方氨基酸溶液15％，维生素溶液5％，人血白蛋白溶液10％，水解蛋白溶液10％，微量元素溶液2％和电解质溶液58％。

7.根据权利要求1所述的充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述无血清培养液由基础培养液和添加剂组成；所述基础培养液为DMEM/F12，所述添加剂包括L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、氢化可的松、人胰岛素、bFGF、辅酶A和丙酮酸钠。

8.根据权利要求7所述的充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述基础培养液中L-谷氨酰胺的浓度为1～3mM，L-抗坏血酸的浓度为10～30mg/L，亚硒酸钠的浓度为15～17μg/L，纤连蛋白的浓度为40～50mg/L，氢化可的松的浓度为8～12mg/L，人胰岛素的浓度为10～15mg/L，bFGF的浓度为15～20μg/L，辅酶A的浓度为90～100mg/L，丙酮酸钠的浓度为1～5mM。

9.采用权利要求1～8任一项所述的提取方法提取得到的间充质干细胞提取物。

10.如权利要求9所述的间充质干细胞提取物在制备美容制剂上的应用。