[发明专利]对木质纤维素类生物质衍生的抑制物耐受性高的酵母、及其构建方法

说明书

本发明提供一种马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)CGMCC No.21814，该菌株对木质纤维素类生物质预处理过程中产生的多种毒性抑制物质包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物的耐受能力优异。表现为该菌株在抑制物混合物下的培养延滞期明显缩短，在含有抑制物和葡萄糖的厌氧培养中乙醇的产量和生产速度提高，利用预处理过的玉米芯进行发酵时乙醇生产速率提高。本发明还提供构建上述菌株的方法，和提高马克斯克鲁维酵母对木质纤维素类衍生的多种毒性抑制物的耐受性的方法。

技术领域

本发明涉及微生物及生物技术领域。具体涉及一种具有提高的生物特性的耐热的马克斯克鲁维酵母，构建其的方法和提高生物工程菌在利用木质纤维素类生物质时对抑制物的耐受性的方法。

背景技术

木质纤维素由于来源广泛、低成本、污染少等优势，作为生物能源与绿色制造等方面备受研究者青睐。木质纤维素中纤维素、半纤维素和木质素之间通过分子键紧密结合形成不易降解的复杂结构。

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素和一些无机化合物组成，它们之间紧密结合形成不易降解的高分子复合物。木质纤维素紧密复杂的结构使得纤维素酶的水解效率低。因此为了提高纤维素的酶促水解效率，人们开发了各种预处理方法来破坏这种致密结构并释放可利用的葡萄糖等单糖(Mussatto et al.,2010)，从而使纤维素酶更易与嵌入的纤维素结合，提高可发酵糖的得率。

化学方法是目前最有效的，最适合工业发展需求的预处理技术，可以有效去除木质素与半纤维素，同时降低成本，常见的处理方法有酸处理、碱处理、有机溶剂处理、离子液体处理等。但存在以下问题：酸法、碱法等常用的预处理工艺会产生大量的抑制物，包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物，严重影响后续的微生物繁殖、细胞活性及产品得率和生产速率，因此会增加糖化及发酵这样的后续步骤的生产成本。解决该问题的主要手段有：优化预处理条件、水解液脱毒处理、进化工程及基因工程改造微生物等。

物理化学方法结合了物理与化学的方法，被认为是很有效的方法。主要有蒸汽爆破、氨纤维爆破(AFEX)、氨循环渗透法(ARP)等，同其他方法一样，在这一预处理过程中木质纤维素的天然结构遭到破坏，酶与纤维素的接触面积变大，水解的糖得率也进一步提高。然而，它也没能解决预处理过程中存在的高耗能、产生有毒副产物、污染环境等问题(Alviraet al.,2010；Mosier et al.,2005)。

预处理过程中部分糖分解并由此产生一些毒性化合物，这些化合物将影响后续的糖化和发酵等过程(Oliva et al.,2003)。由木质纤维素预处理产生的有毒物质可以分为以下几类：弱酸类、呋喃类和酚类化合物(Lin et al.,2015；Mcmillan,1994)。

呋喃和5-羟甲基糠醛作为呋喃衍生物的主要代表，分别源于戊糖和己糖的降解(PalmqvistHahn-Hagerdal,2000)。常见的弱酸类抑制物有甲酸、乙酸和乙酰丙酸，其中乙酸来源于半纤维素的乙酰基，甲酸和乙酰丙酸则来源于糠醛和5-HMF的进一步降解(Morenoet al.,2015)。酚类化合物主要由木质素释放，虽然浓度小但毒性是最强的 (JonssonMartin,2016)。

预处理过程带来的各种类型的抑制物降低了细胞活性和微生物发酵能力。解决抑制物毒性问题迫在眉睫。当前，有两种可行的策略。一、去除抑制物；避免抑制物的产生；减少对微生物的毒性作用。这包括预处理优化即原料选择及处理条件(Kim,2018) 和水解液脱毒即化学脱毒、生物脱毒和物理脱毒等(RobakBalcerek,2020)，但是此方法会带来额外的花费和糖的损失。二、提高发酵微生物的抑制物耐受性(Zhao et al., 2016)。这包括了微生物的筛选、进化工程及遗传/代谢工程(ParawiraTekere,2011)。

考虑到对生物燃料生产而言，木质纤维素是原料之一。如果在生物燃料生产中采用第一种策略，则抑制物的去除程序会大大增加生产成本，阻碍纤维素乙醇商业化，因此，认为提高发酵微生物的抑制物耐受性为更优的解决办法。