[发明专利]恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用有效

专利信息
申请号: 202110473121.8 申请日: 2021-04-29
公开(公告)号: CN113201583B 公开(公告)日: 2022-02-08
发明(设计)人: 毛瑞;王天祚;蔡挺 申请(专利权)人: 国科宁波生命与健康产业研究院
主分类号: C12Q1/6844 分类号: C12Q1/6844;C12P19/34;C12N15/11
代理公司: 上海硕力知识产权代理事务所(普通合伙) 31251 代理人: 郭桂峰
地址: 315016 *** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 恒温 条件下 合成 核酸 方法 试剂盒 应用
【说明书】:

发明公开了恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为:提供一种核酸的步骤,该核酸3’至5’方向依次由M1c、F1c、M、R1、M2c区组成,其中M区包括M1和M2区,所述核酸的5’端的M2c区和3’端的M1c区与同一链上的M区的退火能形成闭合环结构;使用引物第一寡核苷酸I、第二寡核苷酸II分别与所述核酸的F1c区、R1c区退火,以核酸自身为模板进行反应使所述核酸链不断延伸。利用本发明的核酸合成方法,所用核心引物的长度约为30bp,较LAMP和CAMP所用的约为40bp的核心引物缩短了10bp,可节省约四分之一的引物成本,同时还提高了核酸合成的反应速率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域,具体地,本发明涉及一种恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。

背景技术

基于20世纪50年代沃森和克里克提出的碱基互补配对,核苷酸序列互补性的分析方法可直接分析基因所携带的遗传特征。该分析是一种鉴定遗传疾病、癌变、微生物等非常有力的方法。而当样品中靶基因含量非常少时一般不易检测,必须对靶基因进行扩增或使其检测信号放大。作为扩增靶基因的方法,PCR方法被认为是最经典方法(Saiki,Gelfandet al.1988),亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。PCR方法的主要问题是:实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统;样品和反应溶液易受到外部污染,假阳性问题较为突出。例如:一旦PCR中偶然误合成互补链,在接下去的反应中该产物以模板运行,就会造成错误的结果。

另一方面,相较于繁琐的程序温控过程合成核酸,科学家亦开发出在恒温条件下合成核酸的技术(Zhao,Chen et al.2015),主要包括以下几种:依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA),链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶的扩增(HDA)、重组聚合酶扩增(RPA)和竞争性互补介导恒温扩增(CAMP)等。

NASBA,也称TMA(转录介导扩增方法)不需要复杂的温度控制。NASBA需要热变性步骤直到双链DNA形成,但是接下去的转录反应在等温条件下通过T7 RNA聚合酶得以进行。必须要用多种酶组合例如反转录酶,RNase H,逆转录酶酶和T7 RNA聚合酶,多种酶的组合费用相对较高。同时由于复杂的多种酶反应条件,使得该方法成本较高,同时操作较为繁琐使得推广存在一些障碍。

RCA(滚环扩增,Rolling Circle Amplification)旨在模仿微生物中环状DNA的滚环复制过程,对于环状单链DNA模板,与该模板相结合的引物在原方法仅能实现对于环状核酸的扩增。该方法亦存在需多种酶的问题,扩增时间较长。

链替代扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)方法也是人们所知的扩增具有序列与靶序列互补的模板DNA的方法(Zhang,Cui et al.1992)。SDA扩增产物与天然核酸结构不同,并且对用限制酶来断裂或将扩增产物应用到基因克隆上存在限制。这方面也是导致费用较高的主要原因。此外,应用该方法是存在限制酶崩解而导致的非特异信号问题。

依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(Helicase-dependent Isothermal DNAAmplification,HDA)是由美国NEB公司研究人员于2004年发明的一种新型核酸恒温扩增技术(Vincent,Xu et al.2004)。该技术模拟自然界生物体内DNA复制的自然过程,在恒温条件下利用解旋酶解开DNA双链,同时DNA单链结合蛋白(single-strandedDNA-bindingprotein,SSB)用以稳定解开的单链,并为引物提供结合模板,然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又解成单链,并作为下一轮合成的模板进入上述的循环扩增反应,最终实现靶序列的指数式增长。

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