[发明专利]一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：制备多菌灵抗原：

S1:制备人工抗原：将S-甲基异硫脲硫酸盐和氯甲酸甲酯加入去离子水中，采用稀碱液调节至PH＝8.0-8.5，采用冰乙酸调节至PH＝4.5-5.0，加入3，4-二氨基苯甲酸与水，升温至90-95℃反应1-3h，降至室温，过滤，所得滤饼用甲醇打浆，真空干燥，得到目标半抗原；

S2:制备免疫抗原：将所述目标半抗原溶于干燥的DMF中，依次加入1-乙基-3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3-4h，得到半抗原活化溶液；

称取卵清蛋白加入到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，得到蛋白溶液；

S3:将所述半抗原活化溶液多次添加至蛋白溶液中，15℃下振荡反应24h，完毕，采用PBS进行透析，得到免疫抗原的PBS溶液，分装冷冻保存；

步骤二：制备多菌灵单克隆抗体：

S1:动物免疫：将步骤一得到的所述免疫抗原注入到小鼠体内，使其产生抗血清；

S2:细胞融合和克隆化：取产生抗血清的小鼠脾细胞，按数量比5:1与FO骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；

利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌多菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将所述杂交瘤细胞株进行冻存；

S3:单克隆抗体的生产与纯化：复苏所述杂交瘤细胞株，采用动物体内诱生单克隆抗体方法，采用杂交瘤细胞株于动物体内进行诱导，使动物体内分泌多菌灵单克隆抗体，10天后采集腹水，进行腹水纯化，-20℃保存，得到纯化多菌灵单克隆抗体；

步骤三：酶标二抗的制备：

以纯化多菌灵单克隆抗体为免疫原对无病免疫动物进行免疫，得到多菌灵抗抗体；

将多菌灵抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标二抗；

步骤四：酶标板的制备：

制备包被抗原，将包被抗原4-6℃避光孵育16h，洗涤静置30s，拍干，加入封闭液，37℃避光孵育2h，倾去液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存，得到酶标板；

步骤五：检测多菌灵的酶联免疫试剂盒的组建。

2.根据权利要求1所述的一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于：步骤二中，所述杂交瘤细胞株的冻存步骤：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。

3.根据权利要求1所述的一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于：步骤二中，所述杂交瘤细胞株的复苏步骤：复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

4.根据权利要求1所述的一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于：步骤四中，所述包被抗原的制备方法为：将所述目标半抗原溶于干燥的DMF中，依次加入1-乙基-3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3-4h，得到包被活化抗原溶液；

称取牛血清蛋白加入到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，得到牛血清蛋白溶液；

将所述包被活化抗原溶液多次添加至蛋白溶液中，15℃下振荡反应24h，完毕，采用PBS进行透析，得到完全抗原的PBS溶液，分装冷冻保存。

5.根据权利要求1或4所述的一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒，其特征在于：所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的PH为9-10。

6.采用权利要求1-5任一所述的检测多菌灵的ELisa方法的试剂盒，其特征在于：包括酶标板、多菌灵标准品浓缩液溶液、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液和复溶液。

7.根据权利要求6所述的检测多菌灵的ELisa试剂盒，其特征在于：所述复溶液为pH值为7.0、0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求6所述的检测多菌灵的ELisa试剂盒，其特征在于：所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为过氧化脲，所述B液为四甲基联苯胺。