[发明专利]一种分枝杆菌鉴定方法及其生物材料

说明书

本发明涉及一种分枝杆菌鉴定方法及其生物材料。其中，chvd基因应用在分枝杆菌的菌种鉴定中，所述chvd基因可通过包括正向引物和反向引物的通用引物对扩增获得。通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌的chvd基因。分枝杆菌的种属鉴定方法利用所述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的chvd基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，应用chvd基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测chvd基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术。本发明对分枝杆菌的种属分类鉴定结果准确可靠、方法简单、鉴定速度快；通用引物对能鉴定绝大多数常见的非结核分枝杆菌临床分离株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物的分子鉴定领域；尤其涉及一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及chvD基因的应用。

背景技术

目前，结核病依然是严重危害人类健康的慢性传染病，也是单一传染病中死亡人数最多的疾病。世界卫生组织(WHO)最新的全球结核病报告数据显示：2019年全球新发结核病患者约1000万，估算结核病死亡人数约为140万。非结核分枝杆菌(non-tuberculousMycobacteria,NTM)，是指除结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。目前分离到的非结核分枝杆菌已有200余种，多为条件致病菌。近些年来，随着细菌分离技术的不断提高和普及，免疫受损宿主感染菌群的变迁等原因，导致NTM感染和相关疾病的发生呈现上升趋势,有文献报道我国培养阳性标本中NTM分离株占分枝杆菌分离株的比例从1979年的4.3％上升至2010年的22.9％。按照目前的NTM流行病学趋势，随着国家结核病防治规划效果的日益显现，NTM在结核病总体发病中所占的比率逐步提高。因此，预计我国未来NTM的发病率仍有上升空间。所以，对NTM的研究也应该提高重视程度。

NTM肺病的临床症状和体征与肺结核极为相似，缺乏特征性症状，但低热消瘦等全身中毒症状等较肺结核轻。主要临床表现有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等呼吸道症状，也有乏力消瘦等全身症状。因此，在缺乏菌种鉴定的情况下，NTM病常被误诊为结核病。目前治疗NTM肺病尚无特效药物，不同菌种的治疗方案差别很大，且多数NTM对抗结核药物耐药，治疗效果不佳。常见的能够致病的NTM有30余种，针对不同种NTM治疗的药物选择存在较大差异。因此在临床上，快速准确地判定患者是否存在NTM感染，是何种NTM引起的感染，对制定有效的治疗方案具有重要意义。

目前临床上常用的NTM鉴定方法分为两大类：一类是传统生化的方法，该方法依赖一系列繁杂的生化实验，对于慢生长分枝杆菌需要花费数周时间。并且，部分生化实验的结果有时模糊不清，难以准确判读。另外，不同的NTM菌种在生化实验上具有相似的表型，，给传统的生化实验鉴定菌种带来巨大的挑战；另一类为分子生物学方法，以比较同源基因/序列的差异将NTM鉴定至种水平，该方法以操作简单，能快速准确的将分枝杆菌鉴定至种水平，该方法不但缩短了鉴定时间，而且提高一些分枝杆菌之间的分辨能力。并且已经衍生出了各类商业试剂盒(如线形探针杂交技术，DNA芯片技术,多色荧光溶解曲线技术)应用于临床。在日常工作中，借助现有的菌种鉴定标识，如16S rRNA,hsp65,rpoB,16-23S rRNA等开展序列比对时，，常会发现序列与已知菌种差异较大的菌株，难以对菌种做出准确的鉴定。因此，需要利用更多的分子标识，有可能将同一种NTM分为更多的亚种。这种更细致的分型不仅有助于流行病学研究，还有有利于建立不同亚种与患者发病的联系，进而了解宿主的免疫机制与发病机制，类似的研究在国际上还未被关注过。因此，发现更多的分枝杆菌菌种鉴定分子标识，对于提高鉴别能力以及临床诊断和治疗都具有重要的参考价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何简单快速进行分枝杆菌菌种鉴定。

为了解决以上技术问题，

本发明要求保护与分枝杆菌的chvd基因特异结合的物质在制备鉴定或者辅助鉴定分枝杆菌的产品中的应用。