[发明专利]一种环金属铱配合物敏化NiO阴极光电化学生物传感器的制备方法

权利要求书

1.一种用于Dam甲基转移酶检测的环金属铱配合物敏化NiO阴极光电生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)NiO纳米薄膜修饰ITO电极的制备：将面积固定且清洗后的ITO电极浸入含有0.25MNi(NO₃)₂·6H₂O和0.25M六亚甲基四胺的混合溶液中，90℃加热60分钟，自然冷却后用超纯水冲洗3次，在氮气流下干燥，最后将ITO电极放到马弗炉中300℃加热30分钟，自然冷却至室温后得到NiO/ITO电极；

(2)捕获电极的制备：将步骤(1)制备的NiO/ITO电极在室温下浸入体积比为1:1:5的H₂O₂，NH₄OH和H₂O的混合溶液中，在电极表面形成羟基化层，清洗并在氮气流中干燥后，将电极浸入3-氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中孵育12小时，形成富含胺基的自组装层，随后浸入AuNPs溶液中孵育12小时，得到AuNPs/NiO/ITO电极，然后与Cp-DNA的溶液孵育12小时后，滴加6-巯基-1-己胺溶液孵育2小时，得到Cp-DNA/AuNPs/NiO/ITO捕获电极，

所述Cp-DNA的序列为：5’-TTT ACA AGG GCT AGG TTA G-3’，5’端修饰巯基；

(3)信号放大体系：包含1μM发夹H_Dam、160μM SAM、1×Dam buffer和不同浓度的Dam甲基转移酶的甲基化反应混合液在37℃下孵育1小时，然后加入20μL 10×CutSmart缓冲液和10U DpnI，37℃下进行酶切反应1小时，在80℃下反应20分钟灭活，最后，向酶切反应混合物中加入5μL、1μM的发夹H1和5μL、1μM的发夹H2，在37℃下孵育2小时，然后将10μL此反应混合物滴加至步骤(2)制得的捕获电极上，37℃孵育2小时，经清洗后加入发夹H3和H4的混合物继续孵育2小时，得到DNA双链聚合物修饰的Cp-DNA/AuNPs/NiO/ITO电极，

所述1×Dam buffer为含有50mM Tris-HCl、10mM EDTA和5mM 2-巯基乙醇的混合溶液，pH＝7.5；

所述10×CutSmart缓冲液为含有500mM乙酸钾，200mM Tris-乙酸盐，100mM乙酸镁和1mg/mL牛血清白蛋白的混合溶液，pH＝7.9；

所述发夹H_Dam的序列为：5’-GTG AAT AGA GTA TGA TCC GAC TTC TAA CCT AGC TCACTG TGG ATC ATA CTC TAT TCA C-3’；

所述发夹H1的序列为：5’-CAC AGT GAG CTA GGT TAG AAG TCG CCA TGT GTA CAC GACTTC TAA CCT AGC CCT TGT-3’；

所述发夹H2的序列为：5’-ATG TCG TGT ACA CAT GGC GAC TTC TAA CCT AGC TCA CTGACA GAA GTC GCC ATG TGT GTT A-3’；

所述发夹H3的序列为：5’-GTC GCC ATG TGT GTT ACA TCG TTA ACA CAC ATG GCG ACTTCT GT-3’；

所述发夹H4的序列为：5’-ACG ATG TAA CAC ACA TGG CGA CAC AGA AGT CGC CAT GTGTGT TA-3’；

(4)光敏剂的负载：将步骤(3)制得的DNA双链聚合物修饰的Cp-DNA/AuNPs/NiO/ITO电极浸入[(C6)₂Ir(dppz)]⁺PF₆^-的溶液中，孵化30分钟，冲洗后用于光电检测，

所述[(C6)₂Ir(dppz)]⁺PF₆^-，其中C6为香豆素-6，dppz为二吡啶并[3,2-A:2',3'-C]吩嗪；

(5)光电信号检测：将步骤(4)制得的电极插入0.01M PBS pH＝8.0的缓冲溶液中，采用490nm可见光进行激发，偏置电压为-0.1V。