[发明专利]一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法

说明书

本发明涉及一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明通过筛选不同配对抗体得到最佳配对抗体LBJ 3D4和TBU 1A7，以LBJ 3D4作为包被抗体，TBU 1A7‑HRP作为酶标抗体建立双抗体夹心ELISA方法。该方法具有较高的灵敏度，对铜绿假单胞菌具有较好的特异性，而对其他常见的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，即大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌没有交叉反应。本发明方法可用于食品及水中铜绿假单胞菌的检测，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

铜绿假单胞菌引发的各种类型的感染日益成为全球主要的健康问题。铜绿假单胞菌是机会病原体，可引起多种感染，包括败血症，呼吸道感染，心内膜炎，尿路感染和中枢神经系统感染，尤其是在患有严重烧伤或由于癌症或囊性纤维化免疫受损的患者中。铜绿假单胞菌的扩散是由于患者通过接触受污染的物体或使用受污染的食物和水而引起的。更重要的是，铜绿假单胞菌是一种普遍存在的细菌，大多数普遍存在于潮湿的环境中，例如土壤，水和某些食物中。此外，根据欧洲共同体和食品法典委员会的规定，所有水和食物中均应不含铜绿假单胞菌。因此，为了确保食品安全并保护人类健康，迫切需要一种快速，特异性和灵敏的铜绿假单胞菌检测方法。

一种基于“金标准”培养的铜绿假单胞菌的传统检测方法应用于铜绿假单胞菌的检测。然而，该方法不能达到所需的期望灵敏度，并且该方法涉及一系列繁琐的过程，包括样品制备，富集，细菌培养和目标细菌鉴定。整个过程本质上是劳动密集型且耗时的，因此不适用于某些情况，并且可能导致2-3天的检测延迟。基于核酸的方法已被广泛使用，包括聚合酶链反应(PCR)、多重PCR和回路介导的等温扩增(LAMP)。基于核酸的方法涉及复杂的步骤，例如DNA提取，PCR扩增和凝胶电泳。尽管已知PCR方法可以为病原体检测提供敏感的结果，但是它需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，这使其不适合现场检测。由于生物传感器的高灵敏度和特异性，它已被广泛认为是一种非常有希望的病原体检测分析工具。但高度依赖于复杂的仪器和分析系统。另外，生物传感器方法还面临高成本，对食物基质的敏感性以及可再现性差的问题。作为一种选择，基于抗原-抗体相互作用的免疫学检测方法因其高灵敏度，特异性和简单性而被广泛用于病原体的检测。它们具有许多优势，例如高通量检测，使用相对便宜的设备以及测试结果的准确性。基于双抗夹心的酶联免疫吸附测定(ELISA)最常用于微生物检测，其中需要一对抗体(标记的捕获单克隆抗体和固定的检测单克隆抗体)来鉴定不同的抗原结合位点。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，其稳定性好、成本低、能同时检测大批量样本，为检测食品中和水中铜绿假单胞菌提供了免疫学方法。

本发明的技术方案如下：为实现上述目的，本发明建立了一种基于单克隆抗体的检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用灭活的铜绿假单胞菌作为免疫原免疫6-8周龄的BALB/c小鼠并经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

所述灭活的铜绿假单胞菌具体包括铜绿假单胞菌(CICC 21625)，铜绿假单胞菌(CICC 10351)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，铜绿假单胞菌(ATCC 15442)，铜绿假单胞菌(ATCC 25619)和铜绿假单胞菌(CICC 10299)，均为公开菌株。

其中，用于配对的抗体是通过优化不同配对抗体浓度进行夹心法配对，并通过多次重复试验确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。具体如下：

一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株LBJ 3D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20781。