[发明专利]一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。所述构建方法包括：将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。本发明发现针对小鼠Ano5基因第360位设计打靶载体进行突变，得到的颌骨或骨干发育不良小鼠模型病理改变明显，且呈现和患者临床表现相似的骨骼病变特征，利用此构建方法得到的小鼠模型可以为揭示颌骨或骨干发育不良疾病的分子机制提供有效安全的实验工具。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。

背景技术

颌骨或骨干发育不良(Gnathodiaphysia Dysplasia，GDD)是一种罕见的常染色体显性遗传病，病变主要累及口腔和长骨。临床表现为颌面部畸形、下颌骨牙骨质/骨发育不良和颌骨骨髓炎等；管状骨侧弯、骨皮质增厚和骨脆性增加等。患者在青少年时期可多次发生无诱因骨折，血中碱性磷酸酶水平增高，牙龈溢脓和拔牙后不易愈合。该病给患者及其家人造成极大的精神痛苦和沉重的经济负担，目前针对GDD仅限于手术和姑息治疗，无特异性的药物干预措施。因此探究GDD发生的分子机制，对于指导其临床治疗具有重要的意义。

ANO5(Anoctamin 5/TMEM16 E)是GDD的致病基因，其编码蛋白是ANO家族成员之一。ANO5蛋白具有8个跨膜结构域，以同源二聚体的形式构成通道，可能发挥钙离子激活的Cl^-通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)或磷脂爬行酶(Phospholipidscramblase，PLSCR)的功能。ANO5在成年小鼠的颅盖骨、股骨和下颌骨中高度表达，其杂合突变与GDD的发生密切相关。迄今为止，报道显示至少有10个ANO5基因突变可导致GDD。体外研究发现，Cys356Arg和Cys356Gly突变可以导致ANO5蛋白不稳定，更易于被蛋白酶体降解；Thr513Ile突变可使细胞发生磷酯酰丝氨酸外翻，从而导致骨骼发生病理性矿化。

利用动物模型对GDD的发病机制进行研究也逐渐被重视。几个针对Ano5的不同外显子区域的基因敲除小鼠或者兔子动物模型，主要表现为：①骨骼肌病变表型，如成肌细胞膜融合和修复障碍；②精子活动度减低；③部分GDD骨病变特征。Rolvien等首次利用CRISPR/Cas9方法建立Ano5基因T491F突变(人类p.Ser500Phe)小鼠模型，对12和24周龄小鼠进行了影像学和组织学表型鉴定，仅有纯合突变小鼠表现轻微肌肉质量增加的改变，却未表现任何骨骼相关的病理特征。

到目前为止，多数关于ANO5基因突变的研究，均只限于体外实验，无法在动物体内模拟发病现场，不能真实再现疾病发生的分子事件。建立动物模型是研究ANO5基因突变导致GDD的更佳途径。只有一篇文献报道Ano5基因T491F突变小鼠模型，该突变相当于人类p.Ser500Phe突变，首次是由德国学者Rolvien团队报道，患者是一位中国裔13岁男孩，其临床表现为股骨骨折频发，牙齿萌出障碍，颌骨恶性肿瘤样改变。但是该突变模型并未重复出GDD患者相关的骨骼病理性改变。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。本发明通过突变小鼠基因组中特定位点，得到一种Ano5基因突变小鼠，其呈现与患者临床表现相似的骨骼病变特征，适用于颌骨或骨干发育不良疾病的分子机制的研究。

第一方面，本发明提供一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型构建方法，包括：

将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。

进一步地，基于CRISPR/Cas9方法，通过打靶载体将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。

进一步地，所述打靶载体包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述构建方法包括：

构建打靶载体，并转染ES细胞；