[发明专利]一种鉴定SMV-SC3的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供一种鉴定SMV‑SC3的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法，包括1对内引物、1对外引物和1对环引物。本发明能够特异检测出SMV‑SC3病毒，具有特异性强、灵敏度高、反应速率快、操作简单、经济的优点，用于田间大豆花叶病毒SMV‑SC3早发现早防治，也能用于大豆抗SMV‑SC3种质的鉴定和基因定位，对大豆栽培和育种具有重要贡献。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种鉴定SMV-SC3的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法。

背景技术

大豆花叶病毒(SMV)是大豆中主要存在的一种病害，严重影响大豆的产量及外观品质。大豆花叶病毒SC3株系在感染早期，大豆叶子没有明显的症状，但会严重影响大豆的产量。王大刚等对黄淮海南部地区山东、河南、安徽大豆花叶病毒株系进行调查时发现23.4％大豆材料叶子中感染SC3株系。侯文焕等对189份大豆材料的SMV-SC3抗性分析发现仅有8份材料具有SMV-SC3抗性。因此对于SMV-SC3的研究迫在眉睫。目前对于SMV的检测方法有生物学法、酶联免疫反应(ELISA)、聚合酶链式扩增反应(PCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)等。生物学检测法为主要方法，通过观察植株感病的症状鉴定材料是否抗大豆花叶病毒某个毒株，不仅耗时长(一个月左右)，而且通过肉眼观察的判断结果准确性低，尤其SMV-SC3毒株侵染大豆在初期时症状表型不明显，利用生物学早期检测存在较大困难。ELASA通常会引起假阳性，且对操作人员的要求较高；PCR和qPCR检测均需要专门的仪器，检测费时费力，且无法特异的对某一种花叶病毒进行检测。环介导等温扩增(LAMP)技术是由Notomi等开发的一种快速、灵敏、操作简单的可视化等温检测技术，而且LAMP技术用3对引物进行反应，增加了检测的特异性。近年来，该方法广泛应用于病毒、转基因作物，多种病原菌等的检测。

袁俊杰等通过在反应体系中添加逆转录酶RPA(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)，建立了SMV的检测体系，但是该方法存在一定的缺点，需要除去蛋白才可进行后续试验。张雯娜等建立了一步法RT-LAMP检测大豆花叶病毒的方法，但该方法无法确定感染具体的大豆花叶病毒株系。近年来，随着基因组测序技术迅速发展，大豆花叶病毒株系基因组序列不断公布，另外研究者们不断研究出新的基于LAMP的SNP检测方法，使LAMP检测的特异性更强，如AS-LAMP、LAMP-OSD、LAMP-ASO和PE-LAMP等。AS-LAMP是在反向内引物的5’端设计特异性位点，实现特异性扩增。但是该方法的引物依赖于单核苷酸多态性在靶基因中的位置，这使得这个方法在引物设计上缺乏灵活性。LAMP-OSD是将LAMP扩增与一步链置换反应(One-step strand displacement，OSD)联用，反应体系中加入可以对LAMP产物进行特异性识别的OSD探针，借助实时荧光定量PCR仪检测目标序列。模板中加入具有干扰性的其他模板时，LAMP-OSD荧光信号易受影响，而不利于信号的检测。一方面LAMP-OSD需要依赖昂贵的仪器，另一方面容易受其他模板的影响，SMV-SC3进行检测时，可能同时存在其他株系，所以不适合用来特异性检测SMV-SC3。LAMP-ASO是利用不同等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide，ASO)做成芯片，通过抗原抗体反应来检测LAMP反应的产物，多用于人类疾病基因DNA突变体的检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种鉴定SMV-SC3的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法，能够特异检测出SMV-SC3病毒，具有特异性强、灵敏度高、反应速率快、操作简单、经济的优点，用于田间大豆花叶病毒SMV-SC3早发现早防治，也能用于大豆抗SMV-SC3种质的鉴定和基因定位，对大豆栽培和育种具有重要贡献，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种鉴定SMV-SC3的LAMP引物组，包括1对内引物、1对外引物和1对环引物，序列如下：

内引物SC3-FIP-2：