[发明专利]一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法

权利要求书

1.一种同时分离小麦细胞质、小麦叶绿体和小麦原生质体的方法，包括如下步骤：

(a1)取切碎的小麦叶片，置于0.3-0.5M甘露醇溶液，黑暗条件下静置5-15min；

(a2)完成步骤(a1)后，过滤，收集沉淀；之后加入酶解液，避光，酶解；

所述酶解液的溶质及其浓度为15-25mM MES、0.2-0.6M甘露醇、10-30mM KCl、1％-2％纤维素酶、0.5％-1％离析酶、5-15mM CaCl₂、0.1％-0.5％BSA，3-8mMβ-巯基乙醇，溶剂为水，pH值自然；

(a3)完成步骤(a2)后，加入W5洗液，26-30℃、60-80rpm避光处理5-15min；

所述W5洗液的溶质及其浓度为100-200mM NaCl、100-150mM CaCl₂、2-8mM KCl、1-4mMMES，溶剂为水，pH值5.7-6.0；

(a4)完成步骤(a3)后，过滤，收集滤液；之后离心，收集沉淀；沉淀用所述W5洗液洗涤3次以上；

(a5)完成步骤(a4)后，加入FMA溶液、FMB溶液和FMC溶液，离心，收集FMB溶液和FMC溶液界面间的液体，即小麦原生质体；

所述FMA溶液的溶质及其浓度为0.3-0.6M蔗糖、0.8-1.2mM MgCl₂、pH7.0、3-7mM HEPES，溶剂为水，pH值自然；

所述FMB溶液的溶质及其浓度为0.2-0.5M蔗糖、0.8-1.2mM MgCl₂、pH7.0、3-7mM HEPES、0.05-0.15M山梨醇，溶剂为水，pH值自然；

所述FMC溶液的溶质及其浓度为0.8-1.2mM MgCl₂、pH7.0、3-7mM HEPES、0.3-0.8M山梨醇，溶剂为水，pH值自然；

(a6)完成步骤(a5)后，向小麦原生质体中加入WH溶液，避光，3-6℃过夜；

所述WH溶液的溶质及其浓度为0.3-0.8M甘露醇、10-30mM KCL、2-6mM MES，溶剂为水，pH值5.7；

(a7)完成步骤(a6)后，收集沉淀并加入Homogenization缓冲液，混匀；

所述Homogenization缓冲液的溶质及其浓度为0.3-0.5M蔗糖、2-4mM EDTA、40-60mMTris-HCL、1.5-2.5M DTT，溶剂为水，pH值自然；

(a8)完成步骤(a7)后，进行破碎，离心，收集沉淀；沉淀即为小麦叶绿体；

(a9)完成步骤(a7)后，进行破碎，离心，收集上清液；上清液即为小麦细胞质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a6)中，小麦原生质体和WH溶液的体积比为1:3-5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a7)中，沉淀和Homogenization缓冲液的比例为2.0g小麦叶片获得的沉淀：1-3mlHomogenization缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a8)中，进行破碎为50-60次研磨；离心为3-5℃、600-1000g离心10-20min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a9)中，进行破碎为4-10次研磨；离心为2次以上离心；第1次离心为3-5℃、600-1000g离心10-20min，收集上清液；第2次以上离心为3-5℃、8000-12000g离心10-40min，收集上清液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a2)中，沉淀和酶解液的比例为2.0g小麦叶片获得的沉淀：30-50ml酶解液；酶解的参数为26-30℃、60-80rpm处理3-5h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a3)中，W5洗液和酶解液的体积比为1:0.5-1.5。